从附图6及表3可知，本发明专利提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物体外转 染荧光素酶质粒DNA的效率均显著高于未修饰PEI母体（bPEI1800和1PEI2200)，并且 1PEI2200-SS-5与质粒DNA的质量比分别为3:1和5:1时的体外基因转染效率比市售转 染试剂脂质体2000 (lipofectamine2000)和另一种阳性对照1PEI22000均高；与烷基 化修饰的 PEI (如 bPEI1800-C12-12. 5、bPEI1800-C12-19. 72、lPEI2200-C12-5. 28)相比， 1PEI2200-SS-5的转染效率均比同条件下的这三种烷基化修饰的PEI高，说明本专利提供 的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物是一类高效的体外转染材料，具有很高的应用价值。
[0116] 表3还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的体外基因转染效率（平均值土S. D.)
[0117]
[0118] 注；"31:〇1、51:〇1、101:〇1、151:〇1"表示各样品与质粒口61^4.50的质量比。
[0119] 试验例3 :还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的报告基因沉默效率
[0120] 将能稳定表达荧光素酶报告基因 Iuciferase的细胞UTllue)以4X IO3/孔的密度 接种于96孔中，培养24h后细胞融合度约达到85-90%，开始实施基因沉默。将各还原敏感性 聚乙烯亚胺衍生物与靶向Iuciferase的SiRNA lue (购自上海吉玛制药技术有限公司）以不 同质量比（2. 5:1、3. 75:1、5:1)在HBG缓冲液中等体积混合形成复合物，室温孵育30min。吸 弃96孔板中的旧培养基，用PBS洗涤2次，每孔加入40 μ 1含10%血清或无血清的RPMI1640 培养基，然后每孔加入含有IOpmol SiRNAlue的复合颗粒溶液10 μ 1，培养4h后，吸弃旧培养 基，每孔加入1〇〇μ 1含10%血清的RPMI1640培养基，继续培养20h后，取出培养板，吸弃旧 培养基，用PBS洗2次，每孔加入IX细胞裂解液20 μ 1，37°C振摇15min后，每孔取10 μ 1 裂解液加入50 μ 1荧光素酶底物，用发光检测仪测定转染效率，计算每孔荧光素酶的表达。 分别以lip〇fectamine2000和分子量为22Κ的直线型PEI (1ΡΕΙ22Κ)作为阳性对照。结果 见附图7及表4。
[0121] 从附图7及表4可知，与未修饰PEI母体（bPEI1800和1PEI2200)相比，本发明专 利提供的一组还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物体外递送siRNA沉默报告基因(靶基因)的效率 均大大提高，并且1PEI2200-SS-5体外递送siRNA甚至可以100%抑制靶基因的表达，其靶 基因沉默效率显著高于市售试剂脂质体2000 (lip〇fectamine2000)，且其靶基因沉默效率 比同质量比条件下的烷基化修饰PEI (如bPEI1800-C12-19. 72、1PEI2200-C12_5. 28)高，说 明本专利提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物是一类高效的体外递送siRNA的材料，具有 较高的市场化前景。
[0122] 表4还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的报告基因沉默效率（平均值土S. D.)
[0123]
[0124] 注："2. 5tol、3. 75tol、5tol" 表示各样品与 SiRNAlue 的质量比。
[0125] 试验例4 :还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物体内递送质粒DNA的效率
[0126] 取5-6周龄的的Balb/c小鼠，将小鼠随机分为2组，每组3只，各组分别尾静脉注 射200 μ 1还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物1PEI2200-SS-5 (即通过实施例4制备得到的产 物）与70 μ g荧光素酶质粒的复合物溶液、200 μ 1含有70 μ g裸荧光素酶质粒的生理盐水 溶液，注射后24h，将小鼠用异氟烷麻醉，麻醉5min后，向小鼠腹腔注射200 μ 1荧光素酶底 物，IOmin后用小动物活体成像仪观察体内转染效果。结果见附图8 (每组分别选取一只代 表性小鼠拍照)。
[0127] 在附图8中，al表示尾静脉注射裸荧光素酶质粒组的小鼠，a2表示尾静脉注 射还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物1PEI2200-SS-5与荧光素酶质粒复合物组的小鼠。由 图8可知，裸荧光素酶质粒只能在注射部位局部表达；而还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物 1PEI2200-SS-5可以成功将荧光素酶质粒递送入小鼠体内，并在小鼠体内高效表达。附图 8的结果表明本专利提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物可以成功地实现质粒DNA的体内 递送及高效表达，具有较高的体内应用的开发前景。
【主权项】
1. 一种还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，其化学组成式为"Ri-PEI) X-SS- (PEI-R2)y，化学组成式中两个PEI均为直线型PEI，或者均为分枝状PEI，或者一个为 直线型PEI，一个为分枝状PEI，-SS-为二硫键，&和R2各自独立选择为通式为H- (CH2)n-的 基团，其中n选自0-14中的任意整数。 其结构式为：组成式和结构式中，x和y表示重复单元的个数，且x=l_120,y=l_120成、R2基团各自 独立选择为通式为H-(CH2)n-的基团，n选自0-14中的任意整数；其中直线型聚乙烯亚胺 的重均分子量为200-5000g/mol;分支状聚乙烯亚胺的重均分子量为1250-5000g/mol。2. 根据权利要求1所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，&、R2基团各 自独立选择为氧原子、甲基、乙烷基、丙烷基、丁烷基、戊烷基、己烷基、庚烷基、半烷基、壬烧 基、癸烷基、十一烷基、十二烷基、十三烷基或十四烷基。3. 根据权利要求1或2所述的的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 将聚乙烯亚胺溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，在30-40°C下搅拌溶解，得到聚 乙烯亚胺溶液； (2) 将卤代烃溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，以一定速度滴加至聚乙烯亚胺溶液 中，在30-40°C下，避光反应12-48h; (3) 将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，将该半固体膏状物混悬于5-10ml蒸 馏水中，然后用一定截留分子量的透析袋进行透析，冷冻干燥后制得烷基化疏水修饰的聚 乙烯亚胺； (4) 称取一定量冷冻干燥的聚乙烯亚胺或烷基化疏水修饰的聚乙烯亚胺，溶解于一定 体积的甲醇溶液中，加入一定量的硫化丙烯，在氮气保护条件下60°C，避光反应24-48h; (5) 将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，加入一定体积DMSO溶解该膏状物 后，室温避光反应48-72h，然后用一定截留分子量的透析袋透析该反应液，透析介质为去离 子水，将透析液体冷冻干澡后，即得到还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物； 当制备的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物中的&或馬均选择为氢原子时，则省略烷基化 修饰步骤1-3。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，二氯甲烷和甲醇混合溶剂的体积比 为90:10-99:1 ;脂肪烃基与聚乙烯亚胺的摩尔比为0:1-12:1。5. 根据权利要求3或4中任一项的制备方法，其特征在于，当与卤代烃反应的聚乙烯亚 胺为直线型聚乙烯亚胺时，需在反应体系中添加一定量三乙胺；用于第（4)步反应的聚乙 烯亚胺的pH值需调节为7. 2-7. 4。6. 根据权利要求3、4或5所述的制备方法，其特征在于，硫化丙烯与聚乙烯亚胺反应的 摩尔比为2:1-15:1。7. 根据权利要求1-2任一项所述的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物的在作为体内或体 外核酸递送载体的应用。8. 根据权利要求7的应用，其特征在于，作为体内或体外核酸递送载体时，递送的质粒 DNA的大小为l-30Kb。9. 根据权利要求7的应用，其特征在于，作为体内或体外核酸递送载体时，递送的 siRNA的大小为 15-30bp。10. 根据权利要求7的应用，其特征在于，作为体内或体外核酸递送载体时，还原敏感 性聚乙烯亚胺衍生物与核酸的质量比为1-30:1。
【专利摘要】本发明提供一组还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物，其制备方法及应用。本发明采用脂肪烃基对聚乙烯亚胺进行疏水改性，并进一步二硫键交联，从而得到一组具有一定疏水性、还原敏感性（在肿瘤细胞内二硫键可被还原断裂）、及可生物降解的聚乙烯亚胺衍生物。本发明提供的聚乙烯亚胺衍生物具有的疏水性能提高了材料与生物膜的亲和力，能提高细胞摄取效率；分子内二硫键使材料具有还原环境响应性和生物降解性，核酸递送效率高且安全性好。本发明提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物递送DNA的转染效率和递送siRNA的靶基因沉默效率远远高于lipofectamine2000，毒性大大低于lipofectamine2000，是一种高效低毒的核酸递送载体，具有较好的应用前景。
【IPC分类】C12N15/63, C08G81/00, C08G73/02
【公开号】CN104945629
【申请号】CN201410112675
【发明人】高钟镐, 柳珊, 黄伟, 杨飞飞, 金明姬
【申请人】中国医学科学院药物研究所
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2014年3月25日