检测TLR9介导的NF-κB信号通路中关键分子含量的特异性引物、扩增程序及定量试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，是一种基于聚合酶链式反应（PCR)的分子生物学方 法，特别是涉及荧光定量聚合酶链式反应（Q-PCR)。 技术背景
[0002] NF-K B信号通路的作用十分广泛，尤其是在天然抗病毒免疫防御中起到重要的作 用。根据目前的研宄表明，病毒可以通过激活NF- κ B信号通路，进而诱导固有免疫功能改 变，目前研宄病毒致病或者感染机制中更注重宿主在病毒感染过程中免疫反应变化。TLR9 属于胞内受体，可以与细胞自主内吞的配体CpG DNA的结合，募集衔接分子MyD88,形成 TLR9复合体，经过一系列复杂的信号传递，最终激活NF- κ B，启动靶基因的表达，介导多种 反应。TLR9介导的MyD88依赖型NF- κ B信号通路中关键分子的差异表达在抗病毒的研宄 中有着至关重要的作用。
[0003] 在病毒感染机体后，快速有效的检测NF- K B通路中关键分子的差异性表达对我 们研宄病毒的感染机制是非常必要的，但是目前的检方法由于技术缺陷、操作繁琐、试验时 间长、无标准化、成本高等原因让试验者面临很大的困难。目前，还没有开发出一种准确、快 速、简单费用低廉的检测TLR9介导的MyD88依赖型NF- κ B信号通路中关键分子mRNA表达 水平的技术。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有各种技术对病毒感染机制研宄中NF- κ B信号通路中关 键分子差异性表达存在的不足，包括分析耗时长、不能高通量、操作繁琐等缺陷。提供了一 种快速检测对TLR9介导的MyD88依赖型NF- κ B信号通路中关键分子相对含量的技术，可 以反映机体或者是体外培养的细胞在病毒感染的不同阶段NF- κ B信号通路中关键分子的 表达情况。设计了 12对特异性引物，分别为：TLR9、TRAF3、TRAF6、IRAK4、TAKl、TAB2、IKKa、 RELA、I κ Ββ、MyD88、TIRAP、β -Actin，以便用于荧光定量分析。同时，我们对检测的关键分 子在96孔板上进行合理排布，使其得到更加充分的利用，能过更加高效的进行研宄分析。
[0005] 本发明的技术方案如下： 一种检测TLR2/4介导的NF- κ B信号通路中关键分子含量的特异性引物，序列如下： 用于对TLR9进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO : 1、SEQ ID NO :2所示，该 序列与猪TLR9mRNA的一段互补； 用于对TRAF3进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4所示， 该序列与猪TRAF3mRNA的一段互补； 用于对TRAF6进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6所示， 该序列与猪TRAF6mRNA的一段互补； 用于对IRAK4进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8所示， 该序列与猪IRAMmRNA的一段互补； 用于对TAKl进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :0所示，该 序列与猪TAKlmRNA的一段互补； 用于对TAB2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :2所示， 该序列与猪TAB2mRNA的一段互补； 用于对IKKa进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14所示， 该序列与猪IKK a mRNA的一段互补； 用于对RELA进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16所示， 该序列与猪RELA mRNA的一段互补； 用于对Ικ Ββ进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18所 示，该序列与猪I κ B β mRNA的一段互补； 用于对TIRAP进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20所示， 该序列与猪TIRAP mRNA的一段互补； 用于对MyD88进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22所示， 该序列与猪MyD88mRNA的一段互补； 用于对β-Actin进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24所 示，该序列与猪β-Actin mRNA的一段互补。
[0006] 一种检测TLR9介导的NF- K B信号通路中关键分子含量的扩增程序，95°C预变性 30s ;进行40个循环扩增：95°C变性15s，60°C延伸30s，同时采集荧光信号强度。
[0007] 含有权利要求1所述的检测TLR9介导的NF- κ B信号通路中关键分子含量的定量 试剂盒，试剂盒包含荧光定量反应预混酶和含有引物的荧光定量96孔反应板，试剂盒由下 述试剂组成：2. 5mL荧光定量预混酶；3mL无菌水；含有引物的PCR 96孔反应板一块。
[0008] 本发明的有益效果是：TLR9介导的MyD88依赖型NF- K B信号通路中关键分子的 差异表达在抗病毒的研宄中有着至关重要的作用，对病毒性疾病的防治具有重要意义。已 经表明，多种病毒性疾病在感染机体的过程中引起TLR9介导的MyD88依赖型NF- κ B信号 通路中关键分子mRNA表达谱的盖白，通过本发明设计，各种引物的反应温度都进行了标准 化，片段长度也进行了标准化，所有的mRNA定量均可以在相同条件下完成，使不同的实验 间具有可比性。本发明能够建立在mRNA检测的荧光定量PCR技术平台上，不仅可以缩短实 验时间，减少实验经费使用，提高实验结果的准确性和说服力，提供一个全新的检测标准和 评估体系。通过病毒感染后组织采样或者人工培养细胞系快速完成总RNA的提取，并于荧 光定量PCR上进行检测。本发明有效的缩短实验时间、减少经费的使用等。通过优化的实 验反应体系和反应条件，组成检测灵敏、方便的试剂盒，为TLR9介导的MyD88依赖型NF- κ B 信号通路中关键分子提供可靠的检测技术。
[0009]
【附图说明】
[0010] 图1为96孔反应板的整体布局； 图2为TLR9检测的溶解曲线； 图3为TRAF3检测的溶解曲线； 图4为TRAF6检测的溶解曲线； 图5为IRAK4检测的溶解曲线； 图6为TAKl检测的溶解曲线； 图7为TAB2检测的溶解曲线； 图8为IKKa检测的溶解曲线； 图9为RELA检测的溶解曲线； 图10为I κ Ββ检测的溶解曲线； 图11为MyD88检测的溶解曲线； 图12为TIRAP检测的溶解曲线； 图13为β-Actin检测的溶解曲线。
【具体实施方式】
[0011] 以Genbank公布的引物序列为参考，从NCBI上下载已知序列使用DNASTAR软件进 行序列比对，选取针对各个靶基因高度保守与特异的基因片段，用Premier软件设计了相 关引物，引物方向均为Y -3'，具体如下： SEQ ID NO：l CATCTCCCAGGCGGTCAA SEQ ID NO ：2 TCGGCTATGGATGTCATTGTG SEQ ID NO ：3 GCGTGTCAAGAAGGCATCG SEQ ID NO ：4 GTTCCTCAAACTGGCAATCAT SEQ ID NO ：5 GCGTATGACAGCCACCTCC SEQ ID NO ：6 AACCCTCCCTCCGAAGAC SEQ ID NO ：7 GACGATACTCCACCACTCT SEQ ID NO ：8 TGTCTGGGCAAACTTCTC SEQ ID NO ：9 GACCTGAAACCACCAAAC SEQ ID NO： 10 TTCCCAAAGAATAATACCC SEQ ID N0：11 ATAGTGCCATTGGATAGGG SEQ ID NO ：12 AAGGGACATGATCGTGCT SEQ ID NO ：13 AGGACCTGTTGACCTTACT SEQ ID NO ：14 GTATTTATTCCAGTTTCACG SEQ ID NO ：15 GCTCTACCTCCTGTTGTCT SEQ ID NO ：16 GTATCTTCCTTCTCCCATT SEQ ID NO ：17 TGCCCGTTATCCACAAAGA SEQ ID NO ：18 TGAACCACAATGTCGTCGTAT SEQ ID NO ：19 ATGCTTCACAGCCTACCTCA SEQ ID NO ：20 ACGAAAGCCACCATCAGG SEQ ID NO ：21 GTGCCGTCGGATGGTTAGT SEQ ID NO ：22 AACAGGGTTCAGTCGCTTC SEQ ID NO ：23 GGACTTCGAGCAGGAGATGG SEQ ID NO ：24 GCACCGTGTTGGCGTAGAGG 一种检测TLR2/4介导的NF- κ B信号通路中关键分子含量的特异性引物，序列如下： 用于对TLR9进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO : 1、SEQ ID NO :2所示，该 序列与猪TLR9mRNA的一段互补； 用于对TRAF3进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4所示， 该序列与猪TRAF3mRNA的一段互补； 用于对TRAF6进行定量PCR的特异性引物，序列