如SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6所示， 该序列与猪TRAF6mRNA的一段互补； 用于对IRAK4进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8所示， 该序列与猪IRAMmRNA的一段互补； 用于对TAKl进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :0所示，该 序列与猪TAKlmRNA的一段互补； 用于对TAB2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :2所示， 该序列与猪TAB2mRNA的一段互补； 用于对IKKa进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14所示， 该序列与猪IKK a mRNA的一段互补； 用于对RELA进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16所示， 该序列与猪RELA mRNA的一段互补； 用于对Ικ Ββ进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18所 示，该序列与猪I κ B β mRNA的一段互补； 用于对TIRAP进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20所示， 该序列与猪TIRAP mRNA的一段互补； 用于对MyD88进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22所示， 该序列与猪MyD88mRNA的一段互补； 用于对β-Actin进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24所 示，该序列与猪β-Actin mRNA的一段互补。
[0012] 一套用于对TLR9介导的MyD88依赖型NF- κ B信号通路中关键分子mRNA进行相 对定量检测的的引物，及配套内参引物。针对内参基因和mRNA的12对特异性引物分别为 TLR9、TRAF3、TRAF6、IRAK4、TAK1、TAB2、IKK a、RELA、I κ B β、MyD88、TIRAP、β -Actin。
[0013] 一种检测TLR9介导的NF-κ B信号通路中关键分子含量的扩增程序，使得TLR9、 TRAF3、TRAF6、IRAK4、TAK1、TAB2、IKKa、RELA、I κΒβ、MyD88、TIRAP、β-Actin 可以同时 被检测，达到快速分析的目的。
[0014] 含有权利要求1所述的检测TLR9介导的NF- K B信号通路中关键分子含量的定量 试剂盒，针对1'1^9、了狀卩3、了狀卩6、1狀1(4、了六1(1、了六82、11?(1、1^1^、11〇80、]\^〇88、1'1狀？、 β -Actin进行相对定量检测，试剂盒包含荧光定量反应预混酶和含有引物的荧光定量96 孔反应板，试剂盒由下述试剂组成：2. 5mL荧光定量预混酶；3mL无菌水；含有引物的PCR 96孔反应板一块，图1为96孔反应板的整体布局。
[0015] 表1为96孔反应板的各孔中引物的分布情况。举例说明：A1-3,表示A1、A2、A3三 孔；TLR9,表示A1-3中所含的为检测TLR9的特异性引物；阴性对照，表示该孔不含有特异 性引物，作空白对照用。
[0016] 表1 96孔反应板的各孔中引物的分布情况
实施过程包括总mRNA的获取、cDAN制备和检测三个过程。
[0017] 总mRNA的获取：取细胞悬液300 μ L于一干净的EP管中，加入900 μ LTRIZOL，充分 混合均匀后室温作用5-10min。加入氯仿200 μ L，充分摇匀后静置IOmin ; 12000r/min，4°C， 离心15min。取上清，约400 μ L，加入等体积的异丙醇轻摇混勾，4°C静置15min ;12000r/ min，4°C，离心15min。弃去上清，加入75%乙醇Iml轻摇混勾；8000r/min，4°C，离心10min。 弃去上清，放置于干净滤纸上干燥5-10min ;加入10-15 μ LO. I % DEPC水溶解6min，-70°C 保存备用。也可根据实际需求，按照商品化试剂盒要求进行操作。
[0018] cDAN制备：在无 RNA酶PCR管中依次加入3 μ L总mRNA (可根据RNA浓度调整）， IyL 01igo(dT)18引物，9yL无 RNA酶水，70°C孵育IOmin后，立即置冰浴lmin。随后依 次加入反转录缓冲液（5x) 5 μ L，dNTP 5 μ L，RNA酶抑制剂1 μ L，反转录酶1 μ L，42°C孵育 60min进行cDAN合成。最后，70°C孵育IOmin灭活反转录酶，-20°C保存备用也可根据实际 需求，按照商品化试剂盒要求进行操作。
[0019] 检测过程：每个关键分子的检测需要进行3次平行试验，每个反应管的反应体系 可为10-50 μ L。在20 μ L的荧光定量PCR反应体系中，每孔加入样品CDNA和双蒸水的总 体积为9 μ L，再加入预混酶10 μ L，即可开始反应。对cDNA扩增以及定量程序如下：95°C预 变性30s ;进行40个循环扩增：95°C变性10s，60°C延伸30s，同时采集荧光信号强度。通过 常规方法对各PCR管的Ct值进行分析，经与对照内参进行比较后得出结果。图2-13为各 引物111?9、丁狀卩3、丁狀卩6、1狀1(4、丁八1(1、丁八82、11?(1、1^1^、11〇80、]\^〇88、1'1狀？、0-八(^111 检测的溶解曲线。在荧光定量PCR的检测中，引物的特异性和反应条件的优化直接关系着 检测结果的准确性，在实施过程中表现为扩增时溶解曲线的波峰是否单一、稳定。
【主权项】
1. 一种检测TLR9介导的NF- K B信号通路中关键分子含量的特异性引物，其特征在于 序列如下： 用于对TLR9进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO : 1、SEQ ID NO :2所示，该 序列与猪TLR9 mRNA的一段互补； 用于对TRAF3进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4所示， 该序列与猪TRAF3 mRNA的一段互补； 用于对TRAF6进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6所示， 该序列与猪TRAF6 mRNA的一段互补； 用于对IRAK4进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8所示， 该序列与猪IRAK4 mRNA的一段互补； 用于对TAKl进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :0所示，该 序列与猪TAKl mRNA的一段互补； 用于对TAB2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :2所示， 该序列与猪TAB2 mRNA的一段互补； 用于对IKKa进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14所示， 该序列与猪IKKa mRNA的一段互补； 用于对RELA进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16所示， 该序列与猪RELA mRNA的一段互补； 用于对Ik 进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18所 示，该序列与猪IkB|3 mRNA的一段互补； 用于对TIRAP进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20所示， 该序列与猪TIRAP mRNA的一段互补； 用于对MyD88进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22所示， 该序列与猪MyD88 mRNA的一段互补； 用于对0-Actin进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24所 示，该序列与猪0-Actin mRNA的一段互补。2. -种检测TLR9介导的NF- K B信号通路中关键分子含量的扩增程序，其特征在于： 95°C预变性30s ;进行40个循环扩增：95°C变性15s，60°C延伸30s，同时采集荧光信号强 度。3. 含有权利要求1所述的检测TLR9介导的NF- K B信号通路中关键分子含量的定量试 剂盒，其特征在于：试剂盒包含荧光定量反应预混酶和含有引物的荧光定量96孔反应板， 试剂盒由下述试剂组成：2. 5 mL荧光定量预混酶；3 mL无菌水；含有引物的PCR 96孔反应 板一块。
【专利摘要】本发明公开了一种检测TLR2/4介导的NF-κB信号通路中关键分子含量的特异性引物，序列如下：用于对TLR9进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示，该序列与猪TLR9 mRNA的一段互补。本发明有效的缩短实验时间、减少经费的使用等。通过优化的实验反应体系和反应条件，组成检测灵敏、方便的试剂盒，为TLR9介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子提供可靠的检测技术。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104946777
【申请号】CN201510406020
【发明人】杨国宇, 魏战勇, 胡慧, 郑兰兰, 宋月, 索江华
【申请人】河南农业大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月10日