集
[0470] 2. 1. 1 给药
[0471] 给药前称重并计算给药体积（1￥:4111171^;?0:1〇111171^)。
[0472] 给药方式及剂量：静脉（IV)lmg/kg;口服（P0) 5mg/kg。
[0473] 样品：血浆。
[0474] 动物分组：3只/组，每个待测药物分静脉和口服2组。
[0475]2. 1.2样品收集
[0476] 给药后，IV组经眼眶在各个预定时间点（5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4 小时、8小时、24小时）收集30iiL全血，P0组经眼眶在各个预定时间点（15分钟、30分钟、 1小时、2小时、4小时、8小时、24小时）收集30iiL全血，全血离心（6,OOOrpm，5分钟）得 血浆，所有的血浆样品存放在_80°C冰箱等待分析。
[0477] 2. 2定量分析方法
[0478]LC/MS/MS条件如下：
[0479] 电离模式：ESI，正离子；
[0480] 检测模式：MRM;
[0481]定量离子FD2012015 :506. 12/270. 20;
[0482]内标（特非那丁）：472. 40/436. 40;
[0483] 样品处理：50ng特非那丁（乙腈溶液）沉淀蛋白（PPT);
[0484]样品：CD-I小鼠血浆（EDTA抗凝）；
[0485]样品体积：20iiL;
[0486]色谱柱：ACE Oicolumn (50mm*2. 1mm, 5micron)
[0487] 流动相：梯度洗脱，流动相A:水(含0. 1%甲酸)，流动相B:乙腈(含0. 1%甲酸）；
[0488]流速（mL/min):0?9;
[0489] 柱温（°c):室温；
[0490]进样体积（iiL):5;
[0491]时间（分钟）：2.0;
[0492] 3?数据处理
[0493] 用非房室模型法估算药代动学参数(采用WinNonlin软件计算）：
[0494] IV参数：tl/2 (hr) ;C0 (ng/mL) ;AUClast (hr*ng/mL) ;AUCInf (hr*ng/mL) ；AUC Extr(%) ;Vz(L/kg) ;Vss(L/kg) ;CL(mL/min/kg) ;MRT(hr)。
[0495] P0参数：tl/2 (hr) ;tmax (hr) ;Cmax (ng/mL) ;AUClast (hr*ng/mL) ;AUCInf (hr*ng/ mL) ;AUC Extr(%) ;MRT(hr) ;AUC/D (hr*mg/mL) ;F(%)。
[0496] 4?实验结果：
[0497] 表5:本发明化合物口服给药后的药代动力学参数(每组3只小鼠的平均值）
[0499]Cmax:峰浓度
[0500]AUClast :药时曲线下面积
[0501]F:口服利用度
[0502]5?实验结论：
[0503] 本发明实施例1、2化合物具有非常优秀的代谢稳定性，峰浓度、药时曲线下面积、 口服利用度等数据明显优于上市药物索拉非尼，非常具有临床应用前景。说明了当向通式 I的X3位置上引入取代基后，这些取代基从空间构型上阻止了原有的易被代谢的位点（对 比化合物2、3、4在X3位置上是氢），提高了化合物代谢稳定性，保证了化合物在体内的高水 平的血药浓度，从而使本发明化合物的药效又进一步的增加。
[0504] 试验例4
[0505] 1细胞培养
[0506]用含有灭活的10%胎牛血清，100U/ml的青霉素和100 ii g/ml的链霉素以及2mM谷 氨酰胺的RPMI-1640培养基在37°C、5%C02的培养箱中培养786-0细胞。细胞培养起始浓 度为5 X 105个/毫升，每隔3至4天待细胞长满后分瓶传代。将处于对数生长期的肿瘤细 胞用于体内肿瘤的接种。
[0507] 2肿瘤细胞接种与分组
[0508]PBS重悬的786-0肿瘤细胞8X106个/0. 1ml接种于实验动物的右侧胁肋部皮 下，待肿瘤生长到800_3,在无菌条件下，剥离肿瘤，选择生长良好的肿瘤组织，切成瘤块 2x2x2mm3,然后再接种到动物皮下。待肿瘤长至100mm3左右时分组给药，共5组，每组8只。
[0509] 3肿瘤的测量及试验终点
[0510] 使用游标卡尺测量肿瘤体积每周2次，测量肿瘤的长径和短径，其体积计算公式 为：体积=0. 5X长径X短径2。末次测量后处死动物剥离肿瘤称重。根据各组肿瘤重量计 算肿瘤生长抑制率（TGI)。肿瘤生长抑制率（TGI)= (1-T/C)X100%。T:给药组平均相对 瘤重量；C :阴性对照组平均相对瘤重量，肿瘤生长抑制率>60%，并经统计学处理p<0. 05 为有效。
[0511] 表6FD-2013018对786-0人源肾透明细胞异种移植荷瘤小鼠的抑瘤作用（肿瘤重 量）
[0513] 注：a均数土标准误；b与对照组比较。FD-2013018为游离形式
[0514]P值：组 2vs?组 3=0. 999;组 2vs?组 4=0. 386;组 2vs?组 5=0. 001;
[0515]组 3vs.组 4=0. 270;组 3vs.组 5=0. 001;组 4vs.组 5=0. 001;
[0516] 试验例5
[0517] 1细胞培养
[0518] 用含有灭活的10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100iig/ml链霉素以及2mM谷氨酰 胺的McCoy's5a培养基在37°C、5%C02的培养箱中培养HCT116细胞。细胞培养起始浓度为 5X105个/毫升，每隔3至4天待细胞长满后分瓶传代。将处于对数生长期的肿瘤细胞用 于体内肿瘤的接种。
[0519] 2肿瘤接种与分组
[0520]PBS重悬的HCT116肿瘤细胞1. 0Xl〇V〇. 1ml接种于Balb/c裸鼠右侧胁肋部皮下。 待肿瘤生长到800_3时处死动物，在无菌条件下，剥离肿瘤，选择生长良好的肿瘤组织，将 肿瘤组织切成2X2X2mm3瘤块，接种至Balb/c裸鼠右侧胁肋部皮下，共转接60只动物。 待肿瘤长至110mm3左右时分组给药，共5组，每组8只。
[0521] 3肿瘤的测量及实验指标
[0522] 每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行两次测量，测量肿瘤的长径和短径，其体积计 算公式为：体积=0. 5X长径X短径2。末次测量后处死动物剥离肿瘤称重。根据肿瘤重量 计算肿瘤生长抑制率（TGI)= (1-T/C)X100%，其中T为各受试化合物组相对肿瘤重量的平 均值，C为溶剂对照组相对肿瘤重量的平均值。实验结束时，将实验动物安乐处死。
[0523]表7FD-2013018对HCT116异种移植荷瘤小鼠的抑瘤作用（肿瘤重量）
[0525] 注：a均数土标准差；b与对照组比较；FD-2013018为游离形式
[0526]P值：组 2vs?组 3=0. 687;组 2vs?组 4=0. 248;组 2vs?组 5〈0. 001;
[0527]组 3vs?组 4=0. 807;组 3vs?组 5〈0. 001;组 4vs?组 5〈0. 001。
[0528] 对比实验例1 :
[0529] 动物模型制备：
[0530] 取生长良好的786-0实体瘤，无菌条件下切割成约1mm3大小均匀的小块，用套 管针接种于裸鼠右前肢腋窝皮下。定期观察肿瘤生长情况，直至肿瘤体积生长至250~ 550mm3.
[0531] 分组及给药：
[0532] 淘汰瘤体积过大或过小、肿瘤形状不规则的动物，选择状态良好，肿瘤体积250~ 550mm3的荷瘤鼠，共48只，将动物分为6组，分别作为溶媒对照组、3个阳性对照组和2个 受试品组。阳性对照及受试品组，均采用灌胃给药，每天1次；溶媒对照组给予12. 5%乙醇 &12. 5%聚氧乙烯蓖麻油超纯水溶液，每天1次；灌胃容量均为10ml/kg。
[0533] 给药期间每周测量2次瘤径，并计算肿瘤体积，同时记录动物体重。每次给药时观 察动物状态，并对异常状态进行记录。
[0534] 处死动物：
[0535] C02处死动物，剥取瘤块称重，并拍照。对动物进行大体解剖，肉眼观察脏器有无异 堂 巾。
[0536] 观察指标：
[0537]瘤重抑瘤率（IR)=(We_WT) /Wc
[0538] 其中W。、WT分别表示溶媒对照组平均瘤重和给药组平均瘤重。
[0539]BW。为分组时（即dO)称量所得动物体重，BWt为每次称量时的动物体重。如果体重 下降率为负值，表示对我体重增加。
[0540] 统计方法：
[0541] 试验数据用MicrosoftOfficeExcel2003软件进行计算和相关统计学处理。数 据除特别说明外，均用均数土标准误（Mean土S.E)表示，两组间比较采用t-检验。
[0542] 表8FD-1210005对人体肾癌786-0裸鼠移植瘤瘤重的影响
[0544] 注：1.与溶剂对照组比较，*P〈0. 05, #P〈0. 01;
[0545] 2./动物全部死亡，没有相应数据。
[0546] 3.sorafenib为对甲苯磺酸盐，FD-1210005为游离形式
[0547] 对比实验例2
[0548] 动物模型制备：
[0549] 取生长良好的对数生长期的人HCT-116细胞悬液，无菌条件下用注射器接种于裸 鼠右前肢腋窝皮下。定期观察肿瘤生长情况，直至肿瘤体积生长至100~300mm3。
[0550] 分组及给药：
[0551] 选择肿瘤体积100~300mm3的荷瘤鼠48只，将动物分为6组，分别作为溶媒对 照组、3个阳性对照组和2个受试品组。阳性对照及受试品组，均采用灌胃给药，每天1次； 溶媒对照组给予12. 5%乙醇&12. 5%聚氧乙烯蓖麻油超纯水溶液，每天1次；灌胃容量均为 10ml/kg〇
[0552] 给药期间每周测量2次瘤径，并计算肿瘤体积，同时记录动物体重。每次给药时观 察动物状况，并对异常状况进行记录。
[0553] 处死动物：
[0554]C02处死动物，剥取瘤块称重，并拍照。拍照结束后，每个瘤块剪成2份，一份放在 4%多聚甲醛中保存，另一份装入冻存管中，液氮中冻存。对动物进行大体解剖，肉眼观察脏 器有无异常。
[0555] 观察指标：
[0556]瘤重抑瘤率（IR)=(WC_WT) /Wc
[0557] 其中W。、WT分别表示溶媒对照组平均瘤重和给药组平均瘤重。
[0558] 统计方法：
[0559] 试验数据用MicrosoftOfficeExcel2003软件进行计算和相关统计学处理。数 据除特别说明外，均用均数土标准误（Mean土S.E)表示，两组间比较采用t-检验。
[0560] 表9FD-1210005对人结肠癌HCT-116裸鼠移植瘤瘤重的影响
[0562] 注：1.与溶剂对照组比较，*P〈0. 05, #P〈0. 01 ;
[0563] 2./表示动物已死亡。
[0564] 3.-表示此处没有数据。
[0565] 4.sorafenib为对甲苯磺酸盐，FD-1210005为游离形式
[0566] 从体内抗肿瘤试验研究结果显示，实施例2 (FD-2013018)在10mg/kg的剂量下对 786-0和HCT116异种移植荷瘤小鼠即分别达到82%和84. 1%的抑瘤作用，在40mg/kg下更 是均达到92% ;而对比化合物2 (FD-2010005)在20mg/kg剂量下对786-0和HCT116异种 移植荷瘤小鼠分别达到80%和67%的抑瘤作用，在60mg/kg剂量下也只达到80%和71%的 抑瘤作用。这些数据说明，本发明实施例2的化合物（FD-2013018)的体内抗肿瘤活性明显 优于对比化合物2 (FD-1210005)，具有更低的有效剂量和更强的抗肿瘤活性。
[0567] 综上，本发明的化合物具有非常强的体外和体内抗肿瘤活性，以及特别优秀的药 代动力学性质。在与索拉菲尼和对比例2化合物的对比中，本发明的化合物具有更强的体 外和体内抗肿瘤活性，更好的药代动力学性质。
【主权项】
1. 一种式I所示的多取代的吡啶化合物或其药学上可接受的盐： 其中，X1选自式a所示的取代或未取代的五元芳杂环；R4、R5、R6各自独立地选自碳原子、氮原子、氧原子、或硫原子，R 8、R9、Rltl各自独立地选自 氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基； X2选自F或H ; X3选自卤素、-CN、C1-C4烷基、卤代的C1-C 4烷基、C1-C4烷氧基、卤代的C1-C4烷氧 基、-NR11R12中的一种；其中所述Rn、R12各自独立地选自氢、或C 1-C4烷基。2. 根据权利要求1所述的多取代的吡啶化合物或其药学上可接受的盐，其中R4、R5、R6 各自独立地选自碳原子或氮原子。3. 根据权利要求2所述的多取代的吡啶化合物或其药学上可接受的盐，其中R4、R5、R6 不同时为碳原子。4. 根据权利要求2所述的多取代的吡啶化合物或其药学上可接受的盐，其中R4、R5、R6 不同时为氮原子。5. 根据权利要求1所述的多取代的吡啶化合物或其药学上可接受的盐，其中R8、R9、R1(i 各自独立地选自氢、或甲基。6. 根据权利要求1所述的多取代的吡啶化合物或其药学上可接受的盐，其中，X1为7. 根据权利要求1所述的多取代的吡啶化合物或其药学上可接受的盐，其中，X3选自 F、Cl、Br、-CF3、-CN、C1-C2烷基、C1-C 2烷氧基、-NR11R12中的一种；其中所述R11、R 12各自独立 地选自氢、或C1-C2烷基。8. 根据权利要求7中所述的多取代的吡啶化合物或其药学上可接受的盐，其中，X3选 自 F、C1、-CN。9.根据权利要求1所述的多取代的吡啶化合物或其药学上可接受的盐，其中，式I所 示的多取代的吡啶化合物选自以下化合物中的一种：10. 根据权利要求1所述的多取代的吡啶化合物或其药学上可接受的盐，其中，式I所 示的多取代的吡啶化合物选自以下化合物中的一种：11. 根据权利要求1所述的多取代的吡啶化合物或其药学上可接受的盐，其中，式I所 示的多取代的吡啶化合物的药学上可接受的盐选自：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、三 氟甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、1-萘磺酸、2-萘磺酸、乙酸、三氟乙酸、苹果酸、酒石酸、柠 檬酸、乳酸、草酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、苯甲酸、水杨酸、苯基乙酸、或杏仁酸。12. -种根据权利要求1-10中任意一项所述的多取代的吡啶化合物的制备方法，其包 括： 1)使式B所示的化合物与式C所示的化合物在催化剂叔丁醇钾的作用下发生如下反 应，从而得到式D所示的化合物：其中R13为氟、氯、溴或碘； 2) 使式D所示的化合物与式E所示的化合物在催化剂四（三苯基膦）钯或二（三苯基 膦）二氯化钯的作用下发生如下反应，从而得到式F所示的化合物：3) 使式F所示的化合物与式G所示的化合物发生如下反应，从而得到式I所示的多取 代的吡啶化合物：13. 根据权利要求12所述的方法，其中，所述的式B所示的化合物是通过以下方法制备 得到的： 使式A所示的化合物发生卤代反应，从而得到式B所示的化合物：其中R13为氟、氯、溴或碘。14. 一种根据权利要求1-10中任意一项所述的多取代的吡啶化合物的制备方法，其 中，当X 3为NH2时，所述的制备方法包括： 1)使式H所示的化合物与式C所示的化合物在叔丁醇钾作为碱的存在下发生如下反 应，从而得到式W所示的化合物；'* f 其中R13为氟、氯、溴或碘； 2) 使式W所示的化合物与式E所示的化合物在催化剂四（三苯基膦）钯或二（三苯基 膦）二氢化钯的作用下发牛如下反应，从而得到式T所示的化合物： 3) 使式J所示的化合物在钯碳的催化下进行氢化反应，从而得到式K所示的化合物：4) 使式K所示的化合物与式G所示的化合物发生如下反应，从而得到式L所示的化合 物：15. 根据权利要求1-10中任意一项所述的多取代的吡啶化合物或其药学上可接受的 盐在制备用于治疗和 / 或预防 VEGFR-2、VEGFR-3、CRAF、PDGFR- β、BRAF、V600E BRAF、KIT 和/或FLT-3激酶引起的疾病的药物中的用途。16. 根据权利要求15所述的用途，其中，所述的疾病为黑色素瘤、肝癌、肾癌、急性白血 病、慢性白血病、非小细胞肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、卵巢 癌、乳腺癌、骨髓异常增生综合症、食管癌、或间皮瘤。17.根据权利要求1-10中任一项所述的多取代的吡啶化合物或其药学上可接受的盐 在制备用于治疗和/或预防肿瘤或癌症疾病的药物中的用途。
【专利摘要】本发明提供了一种式Ⅰ所示的多取代的吡啶化合物、制备方法、用途及药物组合物：本发明的式Ⅰ所示的多取代的吡啶化合物具有优秀的抗肿瘤作用，能同时抑制多种细胞激酶，还具有明显优秀的药代动力学特征，非常适合口服和静脉给药。本发明的药物组合物可用于治疗肿瘤和癌症。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/4439, A61P35/02, C07D401/04
【公开号】CN104974132
【申请号】CN201410139359
【发明人】易崇勤, 许恒, 陶晶, 林松文, 韩方斌
【申请人】北大方正集团有限公司, 方正医药研究院有限公司, 北大国际医院集团有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月8日
【公告号】WO2015154535A1