一种检测鸡体抗病毒蛋白的试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兽医生物技术领域的检测方法，特别涉及检测鸡体抗病毒蛋白的荧光 定量PCR试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 当受到病毒感染时，病原相关的分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP)被鸡体细胞的模式识别受体（pattern-recognition receptor，PRR) 所识别。PRR激活相应配体，启动鸡体固有免疫通路的信号传导，诱导产生干扰素 (Interferon, IFN)和促炎性细胞因子（pro-inflammatory cytokines)。干扰素进而刺激 干扰素诱导基因（IFN-stimulated genes, ISGs)的表达，产生多种抗病毒蛋白，发挥抗感染 的效应。
[0003] ISG表达的蛋白中，有3种蛋白在多种病毒感染中发挥着重要的拮抗作用，分别介 绍如下。
[0004] (I)IFIT
[0005] ISGs可以表达一类三角形四钛重复段蛋白（IFN-induced protein with tetratricopeptide repeats, IFIT)家族，也称为 ISG56 家族。该家族有 IFIT1、IFIT2、 IFIT3和IFIT54个成员，成簇定位在同一染色体上。各成员均有2个外显子和1个内含子。 在干扰素或病毒等的刺激下，IFIT基因高效表达，产生的蛋白可作用于病毒的复制以及I 型干扰素的反馈调节，在鸡体抗病毒感染中发挥着重要的作用。
[0006] (2) PKR
[0007] PKR的全称为双链RNA(dsRNA)激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Double-Stranded RNA dependent protein kinase)。PKR在鸡体正常生理状态下表达量少。在受到IFN或病 毒复制中产生的dsRNA的刺激时，PKR被激活而发生自体磷酸化，抑制病毒相关基因的翻译 和转录。
[0008] (3) OASL
[0009] 0ASL，即寡腺苷酸合成酶基因家族样蛋白（2'，5' -oligoadenylate synthetase-like protein)。在IFN或病毒dsRNA的刺激作用下，OASL被激活，进而降解 细胞和病毒的RNA，抑制病毒相关蛋白分子的合成，从而发挥其抗病毒感染的作用。因 OASL 主要在细胞浆中发挥作用，因此其在具有胞浆复制特性的病毒的感染中发挥重要作用。 [0010] 检测病毒感染或疫苗免疫鸡体抗病毒物质的表达水平，对于深入了解病毒的致病 机制，研宄开发鸡用新型疫苗、免疫增强剂以及抗病毒药物，均具有非常重要的意义。荧光 定量PCR方法具有敏感、快速、实时和所需检测样品少等优点。如果能够开发出商品化的荧 光定量PCR系列试剂盒，用于鸡体抗病毒效应分子的标准化检测，将为相关的科学研宄和 临床应用带来极大的便利。
[0011] 目前尚无商品化的检测鸡体抗病毒蛋白IFIT5, PKR或OASL的试剂盒。荧光定量 PCR检测这些蛋白的技术，仅被部分研宄型实验室所掌握。而且各实验室所采用的引物、反 应体系及循环参数各不相同，导致了实验结果间的不可比性。
【发明内容】
[0012] 本发明旨在提供一种检测鸡体抗病毒蛋白IFIT5, PKR和OASL基因转录水平的 SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒及其应用。本发明提供的检测方法灵敏度高、特异性强、 线性浓度范围广、重复性好、操作简便及省时，可用于多种样品类型中鸡IFIT5，PKR和OASL 的绝对或相对定量检测。
[0013] 为了实现该目的，本发明设计和筛选了三对特异性引物，从新城疫病毒感染的鸡 胚尿囊液中分别扩增出鸡IFIT5，PKR和OASL基因片段。然后，分别制备了这三个基因的质 粒标准品，用于荧光定量PCR反应条件的优选和标准曲线的建立。通过实际样品的检测应 用评估，表明发明所提供的试剂盒可以用作鸡正常生理状态、疫苗免疫以及病毒感染状态 下，多种样品类型中鸡IFIT5, PKR和OASL基因的绝对或相对定量检测。
[0014] 本发明具体的技术方案如下。
[0015] 1.提供了检测鸡IFIT5，PKR和OASL基因的荧光定量PCR特异性引物。本发明使 用Primer Premier 5. 0设计特异性PCR引物，经过多对引物的筛选、得到扩增效率和特异 性好的一对特异性引物。其核苷酸序列分别为：
[0016] 引物对一：
[0017] IFIT5 Chicken-U :5'-ATGCCGGCTATGCAATAGC-3' ；
[0018] IFIT5 Chicken-L :5'-CTTGCATTGAAACTTCA-3'
[0019] 预计扩增片段大小为151bp。
[0020] 引物对二：
[0021] PKR Chicken-U :5'-TCACAGATTATAGGTGT-3' ；
[0022] PKR Chicken-L :5'-GTTACTCTTTGGTTATAT-3'
[0023] 预计扩增片段大小为94bp。
[0024] 引物对三：
[0025] OASL Chicken-U :5'-ATCATCGAGAGGCGGCTC-3' ；
[0026] OASL Chicken-L :5'-TCCGCGCTACAAGGACAGC-3'
[0027] 预计扩增片段大小为81bp。
[0028] 2.提供了鸡IFIT5, PKR和OASL质粒标准品。将新城疫病毒感染11日龄的SPF鸡 胚，在病毒感染24小时后收取鸡胚尿囊液，应用Trizol法提取其总RNA，然后使用随机引物 将RNA反转录为cDNA。分别使用上述三对引物进行PCR，扩增鸡IFIT5, PKR和OASL的基因 片段。目的长度的扩增片段经琼脂糖凝胶电泳回收后，与PUC57载体连接，转化大肠杆菌。 选择疑似阳性克隆进行测序。测序结果分别与鸡IFIT5，PKR和OASL的基因序列（GenBank Accession No.分别为：XM_421662，NM_204487和NM_205041)进行比对。测序正确的质粒 分别命名为 pUC57-TLR3Ch，pUC57-TLR7Ch 和 pUC57-MDA5Ch。
[0029] 3.本发明提供的检测鸡IFIT5, PKR和OASL的试剂盒，分别包括相应的质粒标准 品（阳性模板对照），浓度为10 μ M的上游引物溶液，浓度为10 μ M的下游引物溶液，2 X荧 光定量PCR预混液（Master Mix)和荧光定量PCR缓冲液（Buffer)。
[0030] 4.本发明可以用于检测多种类型的样品中鸡IFIT5，PKR和OASL的基因转录水平。 样品类型包括但不限于：鸡抗凝全血、鸡脾脏淋巴细胞、鸡外周血淋巴细胞、鸡血清以及鸡 胚尿囊液等。
[0031] 5.本发明提供的检测鸡IFIT5，PKR和OASL的荧光定量PCR方法，包括以下步骤，
[0032] a.待检样品cDNA的制备：
[0033] 首先根据待检样品的种类（如：鸡抗凝全血、鸡脾脏淋巴细胞、鸡外周血淋巴细 胞、鸡血清以及鸡胚尿囊液），提取样品RNA。然后，使用随机引物进行反转录反应，制备样 品的cDNA。
[0034] b.配制PCR反应体系：
[0035] PCR扩增反应的体系均为20 μ 1，包括：2X荧光定量PCR预混液10 μ 1，10 μΜ上游 引物1 μ 1，10 μ M下游引物1 μ 1，荧光定量PCR缓冲液2 μ 1，DNA模板2 μ 1和CldH2O 4 μ 1。
[0036] c.设定PCR扩增反应的程序为：
[0037] 95°C预变性2. 5分钟；95°C 7秒，55°C 10秒，72°C 15秒扩增45个循环，每个循环 结束时检测荧光；熔解曲线分析为95°C 15秒，60°C 50秒，95°C continuous ;最后37°C 30 秒结束。
[0038] d.结果分析：
[0039] 调整荧光定量PCR的扩增基线和阈值设定，以阈值线不低于正常阴性对照扩增 曲线的最高点为准。在阳性对照（质粒标准品）为有效扩增，无模板对照（Non-template control, NTC)无扩增的前提下，读取待测样品的Ct值，进行结果判定：Ct值大于40的样本 为阴性结果；Ct值小于或等于40的样本为阳性结果。
[0040] 根据单一样本的Ct值，可以对其进行绝对定量。根据两个或以上样本的Ct值，可 以对这些样品进行相对定量分析。
[0041] 本发明的有益效果为：
[0042] 1、用途多：本发明所建立