的检测方法可用于多种样品类型（鸡抗凝全血、鸡脾脏 淋巴细胞、鸡外周血淋巴细胞、鸡血清和鸡胚尿囊液等）中鸡IFIT5, PKR和OASL水平的绝 对定量或相对定量检测。该方法可应用于病毒的致病机制的研宄，鸡用新型疫苗、免疫增强 剂以及抗病毒药物的研宄与开发。
[0043] 2、敏感度高：利用本发明所建立的方法检测低至单个拷贝的鸡IFIT5, PKR和OASL 基因时，其扩增的Ct值小于40。
[0044] 3、特异性强：本发明所建立的方法仅特异性的扩增相应基因，表现为单一的熔解 曲线峰值。且对多个对照基因均无扩增。
[0045] 4、检测线性范围广：利用本研宄建立的方法进行鸡IFIT5, PKR和OASL基因的检 测，从低至几个拷贝至IO8个拷贝均有明显的指数扩增。
[0046] 5、重复性好：区内和区间重复试验均取得满意的结果。
【附图说明】
[0047] 图1为鸡IFIT5质粒标准品（7. 5 X IO1~10 8个拷贝，由右及左）的扩增曲线。
[0048] 图2是鸡IFIT5质粒标准品（7. 5 X IO1~10 8个拷贝）的熔解曲线。
[0049] 图3为鸡IFIT5质粒标准品的荧光定量PCR的标准曲线。其中纵坐标为反应的Ct 值，而横坐标为阳性模板浓度的对数值。图中各检测点（绿色圆点）对应的模板浓度分别 为7· 5X IO1~10 8个拷贝（由左及右）。
[0050] 图4为鸡PKR质粒标准品（5 X IO1~10 8个拷贝，由右及左）的扩增曲线。
[0051] 图5是鸡PKR质粒标准品（5 X IO1~10 8个拷贝）的熔解曲线。
[0052] 图6为鸡PKR质粒标准品的荧光定量PCR的标准曲线。其中纵坐标为反应的Ct 值，而横坐标为阳性模板浓度的对数值。图中各检测点（绿色圆点）对应的模板浓度分别 为5X IO1~10 8个拷贝（由左及右）。
[0053] 图7为鸡OASL质粒标准品（2 X IO2~10 8个拷贝，由右及左）的扩增曲线。
[0054] 图8是鸡OASL质粒标准品（2 X IO2~10 8个拷贝）的熔解曲线。
[0055] 图9为鸡OASL质粒标准品的荧光定量PCR的标准曲线。其中纵坐标为反应的Ct 值，而横坐标为阳性模板浓度的对数值。图中各检测点（绿色圆点）对应的模板浓度分别 为2X IO2~10 8个拷贝（由左及右）。
[0056] 图10为病毒性疫苗免疫24h后鸡抗病毒蛋白基因表达水平的检测结果。
【具体实施方式】
[0057] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本 发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖 在本发明的保护范围中。实施例中未特别注明具体条件的方法，均按照常规条件进行。
[0058] 实施例1检测鸡IFIT5, PKR和OASL的试剂盒
[0059] 检测鸡IFIT5, PKR和OASL的荧光定量PCR检测试剂盒，分别包括浓度为10 μ M 的上游引物溶液，浓度为10 μM的下游引物溶液和相应的质粒标准品。所述引物对的核苷 酸序列如SEQ ID NO. 1~NO. 6所示；所述的质粒标准品pUC57-IFIT5Ch，pUC57-PKR Ch和 PUC57-0ASL Ch中IFIT5, PKR和OASL核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 7~NO. 9所示。
[0060] 实施例2检测鸡IFIT5, PKR和OASL的生物试剂的制备方法及应用
[0061] 所述的制备方法包括以下步骤：
[0062] 2.1引物设计
[0063] 从 Genbank 下载鸡 IFIT5, PKR 和 OASL 的基因序列（GenBank Accession No.分别 为：XM_421662, NM_204487 和 NM_205041)，使用 Primer Premier 5. 0 设计几对特异性 PCR 引物，其中对IFIT5, PKR和OASL扩增效果最好的引物序列见附表，预计扩增片段分别为 15Ibp，94bp和8Ibp。引物使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成。
[0064] 2. 2质粒标准品的制备
[0065] 将新城疫病毒弱毒疫苗株LaSota感染11日龄的SPF鸡胚。在病毒感染24小时 后收取鸡胚尿囊液，应用Trizol法提取其总RNA。溶解于20 μ L的TE缓冲液。用核酸/蛋 白紫外检测仪测定RNA的纯度（OD26tlA)D28tl= 2. 0左右为高纯度RNA)。使用随机引物将RNA 反转录为cDNA，保存于-20°C备用。
[0066] 分别以IFIT5, PKR和OASL的引物和相应的cDNA模板进行PCR，扩增相应基因片 段。将目的大小的片段经琼脂糖凝胶电泳回收后，与PUC57载体连接。然后，将重组载体转 化大肠杆菌DH5a感受态细胞，进行细菌培养并提取质粒。阳性质粒的鉴定采用PCR鉴定 和序列测定验证的方法进行。测序结果分别与鸡IFIT5，PKR和OASL的基因序列（GenBank Accession No. :XM_421662，NM_204487和NM_205041)进行比对。测序正确的质粒分别命名 为pUC57-IFIT5Ch，pUC57-PKR Ch和pUC57-0ASL Ch。质粒中目的基因的核苷酸序列（SEQ ID NO. 7~9)如附表所示。
[0067] 用核酸/蛋白紫外检测仪测定质粒的纯度（OD26tlA)D28tl= L 8左右为高纯度DNA) 和浓度，并换算为质粒拷贝数，置于_20°C保存。质粒拷贝数计算公式为：拷贝数（拷贝/ μ L) = 6. 02 X IO23 X 质粒浓度（g/μ L)/MW ;
[0068] MW(g/mol)=质粒大小（bp) X660g/mol · bp。
[0069] 实施例3检测鸡IFIT5, PKR和OASL的荧光定量PCR方法的建立
[0070] 3. 1反应条件的优化
[0071] 首先，使用不同的退火温度进行PCR，分别扩增IFIT5, PKR和0ASL，确定反应的最 佳退火温度。然后，使用不同的引物浓度及最佳退火温度进行荧光定量PCR，优化引物的使 用浓度。将指数扩增期出现最早（Ct值最小）、扩增曲线最佳（典型的S型曲线）以及扩增 产物最多（荧光增量值最高）的反应所使用的引物浓度，作为最佳引物浓度。
[0072] 试验使用了上海生物工程有限公司（Sangon)的荧光定量PCR预混液（Master Mix)和缓冲液（Buffer)，仪器为：Roche LightCycler480Real_time PCR Machine。
[0073] 优化的IFIT5, PKR和OASL荧光定量PCR反应体系均为：
[0074]
[0075] 优化的IFIT5, PKR和OASL荧光定量PCR反应程序均为：95°C预变性2. 5分钟； 95°C 7秒，55°C 10秒，72°C 15秒扩增45个循环，每个循环结束时检测荧光；熔解曲线分析 为 95°C 15 秒，60°C 50 秒，95°C continuous ;最后 37°C 30 秒结束。
[0076] 3. 2标准曲线的制备
[0077] 标准曲线的绘制是荧光定量PCR方法中进行基因绝对定量检测的基础。本发明分 别以8个浓度梯度的鸡IFIT5, PKR和OASL质粒标准品为模板，使用上述优化的反应体系和 程序进行实时荧光定量PCR，绘制反应的标准曲线。
[0078] 3. 2. 1荧光定量PCR检测IFIT5的标准曲线
[0079] 图1显示8个浓度梯度（7. 5X IO1~10 8个拷贝）的鸡IFIT5基因均有明显的指 数扩增。各反应的模板拷贝数、Tm值、Ct值以及3个重复反应的平均Ct值见表1。反应产 物的Tm值在80. 92~81. 11°C，且峰值单一（图2)。据试验结果绘制了反应的标准曲线见 图 3,并得到公式：Y = 42. 32-3. 676X(Error:0. 159, Efficiency:l. 871) ο
[0080] 表1 IFIT5质粒标准品（7. 5 X IO1~10 8个拷贝）的荧光定量PCR反应结果
[0081]
[0082] 3. 2. 2荧光定量PCR检测PKR的标准曲线
[0083] 图4显示5X IO1~10 8拷贝的PKR基因均有明显的指数扩增。表1是各反应孔 的具体结果，包括模板拷贝数、各反应的Tm值、Ct值以及3个重复反应的平均Ct值。反应 产物的Tm值在79. 82~80. 23°C，且峰值单一（图5)。据试验结果绘制了反应的标准曲线 (图 6)，并得到公式