一种铅-纤维蛋白原螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及重金属离子的免疫学检测，具体设及一种铅-纤维蛋白原馨合物及其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]纤维蛋白原（fibrinogen,Fg)其生理功能主要是作为凝血因子I而直接参与凝 血过程。在凝血共同途径中，凝血酶先裂解纤维蛋白原两条Aa链氨基端Argl6-Glyl7释 放出一对纤维蛋白原肤A，形成纤维蛋白原单体I ;在裂解纤维蛋白原两条B0链氨基端 Argl4-Glyl5释放出一对纤维蛋白原肤B，形成纤维蛋白原单体II，暴露纤维蛋白原单体的 聚合部位，通过非共价结合，形成了不稳定的可溶性纤维蛋白原单体。在活化的凝血因子 XIII及Ca"的作用下，纤维蛋白原单体互相交联，生成稳定的可溶性纤维蛋白原，并将血 液的有形成分包绕其中，形成牢固的血栓。
[0003]除参与凝血外，纤维蛋白原还具有其他多种功能，如与血小板膜糖蛋白IIb/IIIa结合而介导血小板聚集反应，参与动脉粥样硬化及肿瘤血行转移等；纤维蛋白原水平还影 响血液粘度，尤其近年来人们发现血浆纤维蛋白原水平升高是屯、脑血管、血栓性疾病的重 要危险因素。血浆纤维蛋白原也是急性时相蛋白，在很多应激状况下，如感染、严重外伤等 也可短时间内升高。
[0004] 铅在体内的含量超过一定水平就会对健康引起难W恢复的损害，它可W铅烟，铅 尘和各种氧化物形式被人体经呼吸道和消化道摄入体内，通过与巧离子的竞争作用，氧化 损伤，细胞调亡等机制，引起W神经、消化、造血系统障碍为主的全身性、渐进性、持久性不 可逆性疾病，而且其危害还可能遗传到下一代。贫血是铅中毒的早期症状之一，铅可抑制血 红素合成过程中许多酶的活性。铅中毒可致血管疫李、腹绞痛、视网膜小动脉疫李和高血 压，时常导致细小动脉硬化。铅的肾损害常表现为间质性肾炎或萎缩性肾炎等病变，肾小管 重吸收功能下降是早期的症状。铅接触还可能影响生殖功能，接触铅的女性发生不孕症、流 产及死胎的机率增多，并可通过胎盘转移到胎儿身上。经口铅中毒者肝脏为主要受损器官 之一，可引起肝肿大呈现黄痘，甚至肝硬变或肝坏死，肝损害可能是肝内小动脉疫李引起 局部缺血所致。铅引起化咐代谢障碍、抑制含琉基酶，干扰植物神经。
[0005] 目前已有大量文献报道铅可W作用于全身各个系统中的蛋白，从而影响机体各组 织器官的机能，已报道的蛋白包括：肾脏组织中的蛋白、脑组织中的蛋白、红细胞中的蛋白、 肝脏组织中的蛋白、肠道组织中的蛋白、肺组织中的蛋白、金属硫蛋白等。
[0006] 研究发现发铅测定误差大，齿铅、骨铅及组织铅取材不易，而尿铅主要反映铅排泄 情况。2006年中国《儿童高铅血症和铅中毒预防指南》规定，儿童血铅水平的筛查可W采用 末梢血或静脉血，但诊断必须采用静脉血。但影响机体免疫球蛋白的蛋白结合铅的含量从 未有过检测。
【发明内容】
[0007] 针对铅污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种铅-纤维蛋白原馨合物及其 制备方法，并建立铅-纤维蛋白原馨合物的定性、定量检测方法，W便定量检测铅-纤维蛋 白原馨合物在评价一个地区铅污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群全血中铅-纤 维蛋白原馨合物，可W间接反映该个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映该个地区铅 污染程度。
[0008] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是；提供一种铅-纤维蛋白原馨合物， 该铅-纤维蛋白原馨合物是铅离子与纤维蛋白原通过琉基或/和半脱氨酸残基馨合而成。
[0009] 本发明还提供一种上述的铅-纤维蛋白原馨合物的制备方法，即体外合成法，包 括W下步骤：
[0010] A)铅-纤维蛋白原塞合物的合成；在提纯源于人体的纤维蛋白原或按照生物学方 法重组的纤维蛋白原中加入铅离子进行馨合反应，得到反应溶液；
[0011] B)铅-纤维蛋白原馨合物纯化；采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液中未 反应的纤维蛋白原、特异性抗体和铅离子，即得铅-纤维蛋白原馨合物。
[0012] 作为优选，所述步骤B)中具体包括W下步骤：
[0013] (1)溶解样品；将上述步骤A)的铅-纤维蛋白原馨合物溶解于生理盐水中，得 铅-纤维蛋白原馨合物溶液；
[0014] 似平衡层析柱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与纤维 蛋白原特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0015] 所述能与纤维蛋白原特异性结合的填料为吸附有可与纤维蛋白原特异性结合物 质的硅胶或树脂；
[0016] (3)上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)所述溶液，然后上柱，使纤 维蛋白原与填料特异性结合；
[0017] (4)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 化2册〇4溶液进行洗脱；
[0018] (5)收集；收集步骤（4)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0019] (6)透析；将步骤巧）中的收集的洗脱液装透析袋，用d地2〇透析除盐，换水S次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0020] (7)平衡层析柱；采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铅特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0021] 所述能与铅特异性结合的填料为吸附有可与铅特异性结合物质的硅胶或树脂； [002引 做上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤做中样本，然后上柱；
[0023] (9)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 化2册〇4溶液进行洗脱；
[0024] (10)收集；收集步骤巧）的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[002引 （11)透析；将步骤（10)的洗脱液装透析袋，用(1化0透析除盐，换水立次后，4°C透 析过夜，收集样本，即得铅-纤维蛋白原馨合物。
[0026] 作为优选，上述铅-纤维蛋白原馨合物的制备方法，还包括W下对铅-纤维蛋白原 馨合物的鉴定步骤，具体包括W下步骤：
[0027] (1)制备胶床；W琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[002引 似加样；取步骤B)中提取纯化得到的铅-纤维蛋白原馨合物，加入上样缓冲液， 并混匀，然后加样于样品槽中；
[002引 做电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0030] (4)检测；在胶床上找出含有铅的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶 解，然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有铅W及检测铅的含量。
[0031] 本发明还提供一种如上述的铅-纤维蛋白原馨合物在制备检测人体内铅-纤维蛋 白原馨合物的试剂或试剂盒中的应用。
[0032] 本发明还提供一种至少包括如上述的铅-纤维蛋白原馨合物作为标准品的试剂 盒。
[0033] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获纤维蛋白原的物质或捕获 金属铅的物质。
[0034] 本发明还提供一种定量检测铅-纤维蛋白原馨合物的方法，W已知含量的上述的 铅-纤维蛋白原馨合物作为标准品，采用W下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联 免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感禪合等离子体质谱结合法、提纯铅-纤维蛋 白原馨合物与酶联免疫结合法、提纯铅-纤维蛋白原馨合物与原子吸收光谱结合法、提纯 铅-纤维蛋白原馨合物与电感禪合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱 或电感禪合等离子体质谱结合法。
[00巧]相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0036] 1.本发明首次合成铅-纤维蛋白原馨合物；
[0037] 2.本发明首次提出铅-纤维蛋白原馨合物可用于制备检测血样中铅-纤维蛋白原 馨合物的试剂或试剂盒中的应用；
[003引 3.本发明实现了铅-纤维蛋白原馨合物的特异性识别和定量检测，W便定量检测 人群全血中铅-纤维蛋白原馨合物的含量，W评价一个地区铅污染程度的应用，为工业地 区的铅污染水平提供间接指标。本发明建立的铅-纤维蛋白原馨合物定量检测方法的准确 度高、重复性好。
【附图说明】
[0039] 图1为本发明所述的铅-纤维蛋白原馨合物的非变性电泳条带图；
[0040] 图2为本发明所述的铅-纤维蛋白原馨合物的电泳条带的同步福射X线巧光分析 图。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0042] 本发明除特别说明外，设及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤；所用试剂、材 料如未特殊说明，均视为可从市购方式购得：
[0043] 提取试剂为PEG溶液、棚酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0044] 捕获纤维蛋白原的物质为可与纤维蛋白原特异性结合的物质，可通过市售获得， 如货号为"NovusA-0577"的人纤维蛋白原抗体Anti-humanFibrinogen,W下实施方式中， 所述与纤维蛋白原特异性结合的物质、抗纤维蛋白原抗体、抗FG抗体均为捕获纤维蛋白原 的物质；
[0045] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磯酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0046] 稀释缓冲液为抑9.6的0. 05M碳酸盐缓冲液，配制方法示例：取1. 5g的化和 2. 93g的Na肥〇3溶解加d地2〇定容至1000血；
[0047] 洗漆缓冲液为抑7.4的0. 15MPBS溶液，配制方法示例：取0.2g的皿2口〇4、2.90g 的化2册〇4? 12&0、8.Og的NaCl、0.2g的KC1、0. 5mLTween-20,溶解加dd&O定容至 1000血； [004引封闭液为牛血清白蛋白溶液，配制方法示例：取0.Ig牛血清白蛋白，加入洗漆缓 冲液稀释定容至lOOmL;
[0049] 终止液为2MH2SO4,配制方法示例：取178. 3血的d地2〇,加浓H2SO4定容至200血；
[0050] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液，配制方法示例：取0.5mL浓度为2g/L的甲基联苯 胺己醇溶液，加底物稀释液稀释至lOmL;