一种检测哈氏弧菌的lamp引物组及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物检测技术领域，更具体地，设及一种检测哈氏弧菌的LAMP引物 组及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 我国的水产养殖业发展迅速，水产养殖种类多样，是世界上唯一的养殖量大于捕 撰量的国家，但我国几乎所有的养殖品种都会受到疾病的威胁，我国的水产养殖业每年会 因病害损失百亿元之巨。造成该种巨大损失的重要原因之一就是缺乏病害快速检测能力。 由于我国的水产病害快速检测技术还不成熟，所W基层工作者对病害的检测往往依赖于肉 眼的观察W及经验的判断，误判误诊现象普遍，缺乏快速有效的检测手段。
[0003] 海马是一种经济价值较高的名贵中药，具有强身健体、补肾壮阳、舒筋活络、消炎 止痛、镇静安神、止咳平喘等药用功能，同时海马还具有很好的观赏价值。目前海马资源紧 缺，价格昂贵，市场需求量在不断增加。然而海马的人工养殖却是一个世界性难题，巨大的 市场空缺主要通过进口来填补。中科院南海所2009年首次引进美国线纹海马，通过几年的 室内小试、室外中试W及规模化生产，已取得成功。目前海马的生物学研究尚不够系统，养 殖技术还不成熟，海马养殖产业仍处于起步阶段。病害问题是目前海马养殖产业所面临的 "瓶颈"之一。而海马的病害如气泡病、烂肤病、肠炎病、烂尾病等的致病机理还未知。其中， 烂尾病和肠炎病是海马养殖中很常见的病害，具有发病广和危害重的特点，一旦发病，海马 的死亡率极高。目前已经有报道哈氏弧菌是造成海马病害的一种致病菌，而我们从海马的 病灶组织的病菌分离鉴定中也发现，哈氏弧菌在肠炎病和烂尾病的发生过程中起着重要的 致病作用。哈氏弧菌是海水中常见的一种致病菌，对鱼、邮、贝类等海水养殖动物均有致病 性。因此，在海马养殖病害检测中建立哈氏弧菌的快速检测方法是非常紧迫而必要的。
[0004] 目前检测致病微生物的方法主要W传统方法为主，即分离鉴定方法，该方法所需 时间长，一般情况下需要5~7山有时达到10~15山很难满足快速检测的要求；近些年 发展起来的PCR技术是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统 方法的前增菌步骤，并且该方法需要较为昂贵的仪器设备和专业的实验技术，在大规模的 养殖环境中很难满足实际操作的需要。ELISA方法具有快速、灵敏的特点，是比较受欢迎的 一种鉴定方法，但是所使用的试剂盒均来自国外，价格昂贵，并且需要配备专口的仪器。环 介导等温扩增技术（LAMP)是继PCR技术之后发展起来的基于检测病菌遗传物质（DNA)的 一种新的扩增技术。该技术依赖于能够识别祀序列上6个特异区域的引物和一种具有链置 换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增祀序列，该技术的特点是 无需特殊昂贵的检测仪器，操作简单，只需简单的恒温设备即可完成PCR扩增，可W满足现 场检测的需要。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有哈氏弧菌检测所存在的上述问题，提供一 种特异性检测哈氏弧菌的特异性引物。
[0006] 本发明的第二个目的是提供含有上述引物的试剂盒。
[0007] 本发明的第S个目的是提供上述试剂盒在检测哈氏弧菌中的应用。
[0008] 本发明的目的是通过W下技术方案予W实现的： 一种检测哈氏弧菌的特异性引物组，所述特异性引物组包含一对外侧引物F3/B3和一 对内侧引物FIP/BIP，引物序列如SEQIDN0;1~4所示。
[0009] 申请人从GeneBank数据库中查找哈氏弧菌V化基因的序列（登录号为； FJ025787)，通过将此序列与其他弧菌的相关基因进行比对W确保其扩增的特异性，用 PrimerPremier5.0引物设计软件来设计引物，得到如SEQIDNO;1~4所示的引物序列。
[0010] 本发明还提供含有上述特异性引物组的、用于检测哈氏弧菌的LAMP试剂盒。
[0011] 优选地，所述LAMP试剂盒中外侧引物的浓度为lOmM，内侧引物的浓度为20mM。
[001引更优选地，所述LAMP试剂盒还包括反应缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs。
[001引优选地，所述LAMP试剂盒的LAMP反应体系为；反应缓冲液2.5uUdNTPs3化、 甜菜碱2uL、MgS042化、外侧引物各0.5化、内侧引物各2uL，DNA聚合酶1化，模 板DM2uL余量用超纯水补齐至25uL。
[0014] 其中，dNTPs的浓度为lOmM，甜菜碱的浓度为7. 5~10M，外侧引物的浓度为lOmM。 内侧引物的浓度为20mM，DM聚合酶的浓度为8000U/mL。
[0015] 其中，所述反应缓冲液可W选择10XThermoPol反应缓冲液(购自New化gland Biol油S公司）。
[0016] 优选地，所述LAMP试剂盒进行LAMP反应条件为；65°C1h，85°C10min。
[0017] 本发明还提供上述LAMP试剂盒在检测哈氏弧菌中的应用。
[0018] 本发明还提供利用上述LAMP试剂盒检测哈氏弧菌的方法，包括W下步骤： 51. 待测样品基因组DNA提取； 52. 反应体系的构建；总量为25uL的LAMP反应体系中含有W下各组分；l〇X ThermoPol反应缓冲液2. 5uL、dNTPs3uL、甜菜碱2uL、M拆O42uL、外侧上游引物 和外侧下游引物各0.5uL、内侧上游引物和内侧下游引物各2uL，DNA聚合酶1uL，模 板DNA2化，模板DNA可W是待检测样品、阳性对照或阴性对照，余量用超纯水补齐至25 ^以反应条件；65°C1h，85°C10min; 53. 结果判定；对反应产物进行观察，若出现白色沉淀，且琼脂糖凝胶电泳后显示梯形 条带，则待测样品中含有哈氏弧菌，若无沉淀出现，则待测样品中不含哈氏弧菌。
[0019] 一般上，可W通过对反应物进行观察判定样品是否感染哈氏弧菌，但是由于LAMP 反应敏感性较高，且反应产物容易被污染而造成假阳性，为了避免该种情况发生，可W通过 对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过观察电泳是否有梯度条带来进一步确定样品是否感 染哈氏弧菌，且不会出现假阳性，结果可靠。
[0020] 优选地，步骤S3中琼脂糖凝胶电泳时，则需配制0. 5X的TBE电泳缓冲液，然后用 2%的琼脂糖凝胶在150V下电泳30min进行检测。
[0021] 在实际用上述试剂盒进行检测时，申请人发现，阴性对照和阳性对照的添加量对 最后的检测结果影响不大，优选阴性对照和阳性对照添加量为2y以而待测样品的用量在 0.5~2uL为宜。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果： 本发明提供了一种检测哈氏弧菌的LAMP引物组及其试剂盒，用该引物组检测哈氏弧 菌，具有特异性强，灵敏度高的特点，用含有该引物组的试剂盒可快速检测水产动物携带的 哈氏弧菌，尤其适用于基层的养殖场及检验检疫机构进行病原检测，具有很好的应用前景， 对于海马病害的预防与治疗具有很好的促进意义。
【附图说明】
[0023] 图1为LAMP扩增不同样品的沉淀示意图，其中，实验组为线纹海马病灶组织样品， 阳性对照组为哈氏弧菌的基因组DNA样品，阴性对照为线纹海马基因组DNA样品。
[0024] 图2为LAMP扩增不同样品的电泳图，其中，M为DNA标准品，实验组为线纹海马病 灶组织样品，阳性对照组为哈氏弧菌的基因组DNA样品，阴性对照1为线纹海马基因组DNA 样品，阴性对照2为超纯水。
【具体实施方式】
[00巧]下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。该些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语 与本领域技术人员熟悉的意义相同。
[002引实施例1弓I物设计及引物特异性检测 从GeneBank数据库中查找哈氏弧菌vUi基因的序列（登录号为；FJ025787)，通过将此 序列与其他弧菌的相关基因进行比对W确保其扩增的特异性，用PrimerPremier5.0引物 设计软件来设计引物，设计的LAMP引物序列巧I物由生工生物工程(上海）股份有限公司合 成）如下： F3 (沈QIDNO;1，外侧上游引物）；5' -CAATTCGAAACAGGCGTG-3' ； B3(SEQIDNO;2,外侧下游引物）；5' -AGTAAAGCTTGCCACACG-3' ； FIP(SEQIDN0;3,内侧上游引物） 5' -CGCCACCACCATATCCATCGGGTTAGTCAATGGTGGAACA-3' ； BIP(SEQIDN0;4,内侧下游引物） 5> -GGATGTAAATGAGTTTGGCTTTCCGTTGTCCTATGTTATACGGGTTG-3>。
[0027]引物的特异性检测；将得到的上述4条引物用于检测多种病原菌(有哈氏弧菌、仓U伤弧菌、轮虫弧菌、副溶血弧菌)，检测结果发现所有非哈氏弧菌未见特异性扩增条带，说明 上述4条引物具有很好的特异性。
[002引实施例2哈氏弧菌LAMP快速检测方法 使用实施例1所述4条引物，建立哈氏弧菌环介导等温扩增（LAMP)快速检测方法，具 体步骤如下： S1.基因组DNA提取；患病W及正常的线纹海马活体均采自广东省湛江的某养殖场， 患病海马5条，正常海马2条。从患病海马体内分离鉴定到哈氏弧菌，提取哈氏弧菌的基因 组DNA作为阳性对照；同时提取正常海马基因组DNA作为阴性对照。
[0029] S2.LAMP模板制备；取少量的患病海马的病灶组织样品，用灭菌的生理盐水冲洗 干净后，放入装有100uL超纯水的离屯、管中，在水浴锅中l〇〇°C煮沸5min,静置冷却至室 温后即可作为LAMP的模板使用。
[0030]S3.反应体系的构建；总量为25uL的LAMP反应体系(表1)中含有W下各组分： 10XThermo化1反应缓冲液2. 5uL、dNTPs3化、甜菜碱2uL、M拆〇42化、外侧上游 弓I物和外侧下游引物各0.5化、内侧上游引物和内侧下游引物各2化，DM聚合酶1化