， 反应模板2 模板为待检测样品、阳性对照W及阴性对照，余量用超纯水补齐至25UL。
[0031]
S4.LAMP扩增反应；将水浴锅的温度调至65°CW下，将装有反应体系的离屯、管放到浮 漂上，然后将浮漂放置在水浴锅中反应60min,此过程中注意不要打开盖子，W避免污染。 然后将另一个水浴锅打开，温度调节至85°C，将浮漂和离屯、管置于85°C反应10min来终止 扩增反应，同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，阴性对照为健康海马组织样品基因组DNA 和超纯水，阳性对照为哈氏弧菌基因组DNA。在扩增过程中注意要带手套操作，由于扩增的 敏感性较高，所W要非常细屯、防止交叉污染而出现假阳性。
[0032]S5.结果判定； (1)根据沉淀判定 LAMP反应过程中，dNTP析出的焦磯酸根离子与反应体系中的Mg"结合，产生大量的焦 磯酸儀，焦磯酸儀为白色沉淀。所W，白色沉淀的出现可W指示是否发生了目的片段的LAMP 扩增反应，而不需要进行电泳和紫外观察。LAMP扩增完成后，管中反应液出现白色沉淀，贝U 说明结果为哈氏弧菌阳性。在本实施例中，如图片1所示，实验组（C)和阳性对照组（B)的 反应液中均出现了白色的沉淀，为哈氏弧菌阳性；阴性对照组(A)中没有沉淀，为哈氏弧菌 阴性。
[0033] (2)根据电泳图片鉴定 为了避免假阳性，可W通过琼脂糖凝胶电泳进一步判定，具体为：取0. 4g琼脂糖溶于 20mL电泳缓冲液（0. 5XT邸)，混合均匀后煮沸，待冷却至约60°C时加入2uLGelStain DM染料，混匀后倾倒凝胶板。凝胶冷却凝固后将5yL的LAMP扩增产物加入凝胶孔中进 行电泳，5V/cm电泳30min。电泳结束后取出凝胶置于紫外灯下观察、拍照。DNA标准品选 用Maker1，若出现了梯形条带则判定为哈氏弧菌阳性。实验组和阳性对照组为出现了梯形 条带，为哈氏弧菌阳性；阴性对照1为线纹海马基因组DM样品，阴性对照2为超纯水，该两 组没有出现条带，为哈氏弧菌阴性（图2)。
[0034] 对比例1哈氏弧菌LAMP快速检测方法 实验方法同实施例2,唯一不同的是所使用的引物不同。本对比例中所使用的引物巧I物设计原则同实施例1)序列如下： F3 (外侧上游引物）；5' -TGCCGAGCCAACATTGTC-3' ； B3 (外侧下游引物）；5, -CGGTGTGTCTGTGTAGAACA-3' ； FIP(内侧上游引物）； 5' -CGGTACCAGCAGCGGACATAAG-TCCAGAGATGGTCAGTGCC-3' ； BIP(内侧下游引物）； 5' -TGAACCTGCGACCGATTGGG-CGAACTCCACCAGTAGCCA-3, 使用本对比例所述引物，结果显示；检测不出哈氏弧菌。
[0035] 对比例2哈氏弧菌LAMP快速检测方法 实验方法同实施例2,唯一不同的是所使用的引物不同。本对比例中所使用的引物巧I物设计原则同实施例1)序列如下： F3 (外侧上游引物）；5' -CCACTAAGTTTTGCTCACGC-3,； B3 (外侧下游引物）；5, -ACTCCACCAGTAGCCATCAA-3' ； FIP(内侧上游引物）； 5, _gtttcgcttgcgcgcttcttac-gccgagccaacattgtctc-3^； BIP(内侧下游引物）； 5' -CTGCTGGTACCGCACCAGTT-GGATTTTCTGCCCATTCCCA-3' 使用本对比例所述引物，结果显示；检测不出哈氏弧菌。
[0036] 说明使用该对比例中的引物组无法检测出哈氏弧菌。
[0037] 实施例3哈氏弧菌LAMP快速检测试剂盒的建立 按下列组成配制哈氏弧菌环介导等温扩增（LAMP)快速检测试剂盒；基因组DNA提取 液、LAMP反应液、反应缓冲液、阳性对照、阴性对照。
[003引其中，LAMP反应液含有一对外侧引物F3/B3和一对内侧引物FIP/BIP、DNA聚合酶、 检测基础液；所述检测基础液为dNTPs、M拆04及甜菜碱，其配方是终浓度为1. 2mldNTPs、 0.6~0.8M甜菜碱和2~6mMM拆04。
[0039] 其中，试剂盒中所述基因组DNA提取液可W为CTAB提取液，其配方为；2 %CTAB， 20mmol/L邸TA，100mmol/LTris-肥1(pH为8. 0)，1.4mol/LNaCl。
[0040] 其中，试剂盒中所述阳性对照为哈氏弧菌基因组DNA;所述阴性对照为正常海马 基因组DNA和水。
[0041] 该试剂盒中反应缓冲液为10X化ermoPol反应缓冲液。
[0042]本发明对上述条件进行了优化，最终确定该试剂盒的反应体系为；10X ThermoPol反应缓冲液(购自New化glandBiol油S公司)2. 5yL、检测基础液7yL(1. 2 mldNTPs3uL、0.8M甜菜碱 2uL、4. 0mlM拆〇42yL)、0. 2ymol/L外侧上游引物和 外侧下游引物各0.5yL、0.2ymol/L内侧上游引物和内侧下游引物各2uL，DNA聚合酶 (0.3U/]iL，购自NewE：nglandBiol油S公司）1yL，反应模板2yL，模板为待检测样品、 阳性对照W及阴性对照，余量用超纯水补齐至25uL。
[0043] 上述LAMP试剂盒的反应条件为；65°C1h，85°C10min。
[0044] 上述LAMP扩增产物的检测；所述扩增反应结束后，根据管内是否有白色沉淀判断 检测结果，有白色沉淀为阳性，即待测样品中含有哈氏弧菌，无沉淀为阴性，待测样品中不 含哈氏弧菌。
[0045] 实施例4实施例3所述试剂盒的特异性 用实施例3中所述的试剂盒检测多种病原菌，包括哈氏弧菌、创伤弧菌、轮虫弧菌和副 溶血弧菌，检测结果发现所有非哈氏弧菌未见特异性扩增条带，而哈氏弧菌的样品出现特 异的梯形扩增条带，说明上述4条引物具有很好的特异性。
[0046] 实施例5实施例3所述试剂盒的灵敏性 将哈氏弧菌的基因组DNA(浓度为1200ng/yL)稀释成四个浓度梯度，稀释后的DNA浓度分别为120ng/uL、12ng/uL、1.2ng/uL、0. 12ng/化，分别取2化各浓度梯度的 DNA稀释溶液作为扩增模板，用无菌超纯水作为阴性对照样品，用实施例3所述的试剂盒进 行检测，检测结果发现除了浓度为0.12ng/uL的样品和阴性对照没有出现扩增条带外，其 他浓度梯度的样品均出现特异条带，因此，该试剂盒的灵敏度为1. 2ng/yL。
[0047] 实施例6利用实施例3所述试剂盒检测养殖场样品 共采集10条海马，5条患病海马和5条健康海马，患病海马怀疑是出现了细菌感染。10 条海马均采自同一个海马养殖场。使用实施例3所述的试剂盒检测该10份样品是否存在 哈氏弧菌的感染，具体步骤如下： LAMP模板制备；取少量的患病海马的病灶组织样品W及正常海马的组织样品，用灭菌 的生理盐水冲洗干净后，放入装有100uL超纯水的离屯、管中，在水浴锅中100°C煮沸5 min,静置冷却至室温后即可作为LAMP的模板使用。
[004引反应体系的构建；总量为25yl的LAMP反应体系(表1)中含有W下各组分；l0X ThermoPol反应缓冲液2. 5uL、dNTPs3uL、甜菜碱2uL、M拆O42uL、外侧上游引物 和外侧下游引物各0.5uL、内侧上游引物和内侧下游引物各2uL，DNA聚合酶1uL，上 述的LAMP反应模板2uL。
[004引LAMP扩增反应；将水浴锅的温度调至65°CW下，将装有反应体系的离屯、管放到浮 漂上，然后将浮漂放置在水浴锅中反应60min,此过程中注意不要打开盖子，W避免污染。 然后将另一个水浴锅打开，温度调节至85°C，将浮漂和离屯、管置于85°C反应10min来终止 扩增反应。
[0050]检测结果显示，5条病海马样品的反应管中均出现了白色沉淀，而正常海马样品未 出现白色沉淀。为了避免出现假阳性，通过琼脂糖凝胶电泳进一步检测，检测结果与肉眼观 测的结果一致，上述一组引物W及试剂盒能够在病海马样品中检测到哈氏弧菌的存在，而 正常海马中则检测不到。
【主权项】
1. 一种检测哈氏弧菌的特异性引物组，其特征在于，所述特异性引物组包含一对外侧 引物F3/B3和一对内侧引物FIP/BIP，引物序列如SEQ ID N0:1~4所示。2. -种检测哈氏弧菌的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述特 异性引物组。3. 根据权利要求2所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中外侧引物的浓度为 10mM，内侧引物的浓度为20mM。4. 根据权利要求3所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应缓冲液、 DNA聚合酶和dNTPs。5. 根据权利要求4所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的LAMP反应体系为： 反应缓冲液2.5 y UdNTPs 3 yL、甜菜碱2 UUMgSO4 2 yL、外侧引物各0.5 yL、内侧 引物各2 yL，DNA聚合酶I yL，模板DNA2yL，余量用超纯水补齐至25 yL。6. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行LAMP反应的条件为： 65〇C I h,85〇C 10 min〇
【专利摘要】本发明涉及微生物检测技术领域，更具体地，公开了一种检测哈氏弧菌的LAMP引物组及其试剂盒，所述引物组包含一对外侧引物F3/B3和一对内侧引物FIP/BIP，引物序列如SEQ ID NO：1～4所示；用该引物组检测哈氏弧菌，具有特异性强，灵敏度高的特点，用含有该引物组的试剂盒可快速检测海马携带的哈氏弧菌，尤其适用于基层的养殖场及检验检疫机构进行病原检测，具有很好的应用前景，对于海马病害的预防与治疗具有很好的促进意义。
【IPC分类】C12Q1/68, C12R1/63, C12Q1/04
【公开号】CN104988220
【申请号】CN201510361773
【发明人】林强, 王信, 罗伟, 秦耿, 刘帅帅
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月26日