Cas9-核酸复合物及其相关用图
【专利说明】CAS9-核酸复合物及其相关用途
[0001] 关于联邦资助研究的声明
[0002] 本发明是由美国国立卫生研究院O^JationalInstitutesofHealth)资助的在批 准号呪4-AI057157下由政府支持进行的。政府在本发明中具有一定权利。
[0003] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请要求2013年1月16日提交的美国临时申请号61/753,046和2013年11 月18日提交的美国临时申请号61/905, 368的优先权，两者都通过引用W其全文特此结合。
[0005] 领域
[0006] 本披露设及化s9-核酸复合物及其相关用途。在某些实施例中，本披露设想了被 遗传工程化W表达在此披露的化s9-核酸复合物的转基因植物和动物。在某些实施例中， 本披露设及使用被配置成表达在此披露的化s9-核酸复合物的载体治疗或预防疾病、病 症、癌症、病毒感染、或其他病原性感染的方法。
[0007] 背景
[0008] CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列）-CAS(CRISPR-相关）基因提供针对 外源核酸的防御。该些系统利用由重复序列侧翼间隔区组成的小CRISPRRNA(crRNA)的阵 列来识别它们的祀标并且利用某些CAS蛋白来介导祀向降解。参见黑尔化ale)等人，细 胞似11)，2009，139,945-956;加西乌纳斯佑331111133)等人，美国国家科学院院刊化〇〇 化tlAcadSciUSA) ,2012,109,E2579-2586;季憂克（Jinek)等人，科学（Science) ,2012， 337,816-821 及迪杜森科值atsenko)等人，自然通讯（化1:Commun)，2012, 3,945。加尔 诺佑3111日311)等人，自然（化化'日），2010,468,67-71报道了〇?15?1?/^33细菌免疫系统裂解 瞻菌体和质粒DNA。己朗格炬arrangou)等人，科学（Science) ,2007, 315,1709-1712报道 了CRISPR在原核生物中提供针对病毒的获得性抗性。Marraffmi(马拉弗米）和宗特海默 尔（Sontheimer)，科学（Science)，2008, 322,1843-1845 报道了CRISPR干扰限制葡萄球菌 中通过祀向DNA进行的水平基因转移。
[0009] 霍瓦特Olorvath)等人，W0 2007025097,报道了一种或多种Cas基因或蛋白质用 于调节细胞对祀核酸或其转录产物的抗性的用途。
[0010] 黑尔等人报道了与化SRAMP模块复合物一起作用来裂解RNA的CRISPRRNA的基 本特征和合理设计。分子细胞（MolecularCell) 201245, 292-302。
[0011] 丘（化0)等人报道了使用化s9RNA指导的内切核酸酶进行人细胞中祀向基因组工 程化。自然生物技术（化化reBiotechnology)，2013,31，230-232。
[0012] 马里（Mali)等人报道了通过化s9进行的RNA指导的人基因组工程化。科学 (Science)，2013,339:823-26。还参见季憂克等人，eLife，2013,2:e00471。
[0013] 涅克拉索夫（Nekrasov)等人报道了使用化S9RNA指导的内切核酸酶进行模式植 物本氏烟草的定向诱变。自然生物技术（化tBiotechnoL)，2013,3U8):691-3。
[0014] 在此引用的参考文献并非对现有技术的承认。
[0015] 概述
[0016] 本披露设及化s9-核酸复合物及其相关用途。在某些实施例中，本披露设想了被 遗传工程化W表达在此披露的化s9-核酸复合物的转基因植物和动物。在某些实施例中， 本披露设及使用被配置成表达在此披露的化s9-核酸复合物的载体治疗或预防疾病、病 症、癌症、病毒感染、或其他病原性感染的方法。
[0017] 在某些实施例中，本披露设及使用被配置成表达祀向病毒或病原性核酸或与致癌 基因相关联的RNA的Cas9-核酸复合物的载体治疗或预防癌症或病毒感染或其他病原性感 染或其他遗传性疾病的方法。在某些实施例中，本披露设想了被遗传工程化W表达在此披 露的化s9-核酸复合物，W用于癌症、遗传性疾病、预防或治疗病毒或其他病原性感染目的 的转基因植物和动物。
[0018] 在某些实施例中，本披露设及分离或重组核酸、克隆载体、W及含有它们的重组细 胞。在某些实施例中，本披露设及治疗或预防病毒感染或癌症或其他遗传性疾病的方法，该 些方法包括向对其有需要的受试者给予有效量的被配置成表达祀向病毒核酸或与致癌基 因相关联的RNA的Cas9-核酸复合物的载体。
[0019] 在某些实施例中，本披露设想了敲除内源性细菌或其他基因或防止在原核、真核、 哺乳动物、人、昆虫或植物细胞中产生祀蛋白的组合物和方法。在某些实施例中，本披露设 及免疫刺激组合物W及如在此所述的用途。
[0020] 在某些实施例中，本披露设及包含W下的重组核酸：一个包含化s9或细菌化s9基 因的序列；一个编码RNA的序列，其中该RNA包含被配置成在转录之后与该化s9结合的一 个第一区段和被配置成结合祀核酸的一个第二区段。在某些实施例中，细菌化s9mRNA翻译 具有SEQIDNO: 1的化s9或其保守变体。在某些实施例中，化s9具有一个富含精氨酸的 基序、一个RuvC-III基序、W及一个RuvC-IV基序。在某些实施例中，Cas9mRNA翻译与SEQ IDN0:1具有大于约5%的一致性的Cas9、与SEQIDN0:6具有10%-致性的区段、与SEQ IDN0:7具有10% -致性的区段、W及与SEQIDN0:8具有10%-致性的区段。在某些实 施例中，该第一区段包含SEQIDN0:5或SEQIDNO: 11或与其具有60%或更大的一致性。
[0021] 在某些实施例中，第一区段包含与被配置成结合细菌Cas9的tracrRNA或scaRNA 相关联的细菌衍生的序列。在某些实施例中，该第一区段形成一个发夹结构。在某些实施例 中，该祀序列为病毒基因组或病毒RNA，或与致癌基因相关联的mRNA或微RNA。在某些实施 例中，RNA的该第二区段是单链的。在某些实施例中，第二区段包含多于10、15、20、25、30、 50、或100个被配置成与祀序列杂交的连续核巧酸。在某些实施例中，Cas9基因为人、动物 或植物编码优化序列。在某些实施例中，Cas9基因包含（SEQIDN0:9)或与其具有60%或 更大的一致性。
[0022] 在某些实施例中，本披露设想了包含W下的重组核酸：一个包含化s9或细菌化s9 基因的序列；一个编码SEQIDN0:5或SEQID側:11或与其具有10%、30%、60%、70%、 80%、90%、95%或更大一致性的缀合编码第SRNA的序列的序列，其中该第SRNA包含8 个被配置成与祀序列杂交的连续核巧酸。
[0023] 在某些实施例中，本披露设想了包含W下的重组核酸：一个编码单个嵌合RNA 5' -[x]nCUCGIjAAUUAAUAAACCAUGAAAGIjAUGGUUUAIjUAGAUUGIjIjG
[刊m-3'（SEQIDNO: 13)的序列，其中X和Y在每次出现时独立地为任何核巧酸，并且n和m 独立地为8、10、15、20、25、30、50、或100多个连续核巧酸且通常少于50、100、或200个核巧 酸；一个祀向序列或非祀向序列，通常为至少一个祀向序列，通常Y为非祀向序列，和/或n 或m中的一个少于10个核巧酸，其中该重组核酸还任选地编码一个包含化s9或细菌化s9 基因的序列。
[0024] 在某些实施例中，祀序列为病毒基因组或RNA，或与致癌基因相关联的mRNA或微 RNA。在某些实施例中，第SRNA包含多于10、15、20、25、30、50、或100个被配置成与祀序列 杂交的连续核巧酸。在某些实施例中，化s9或细菌化s9基因为人密码子优化序列。在某 些实施例中，Cas9基因包含（SEQIDN0:9)或与其具有10%、30%、50%、60%、70%、80%、 90 %、95 %、98 %或更大的一致性。
[00巧]在某些实施例中，本披露设及包含在此披露的核酸的重组载体。重组载体可选自 遗传工程化的质粒、瞻菌体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、或遗传工程化的病毒。
[0026] 在某些实施例中，本披露设及用在此披露的重组载体转化的细菌、原核、真核、昆 虫、哺乳动物、或植物细胞。
[0027] 在某些实施例中，本披露设及包含W下的分离或重组核酸；一个编码细菌或任何 化s9mRNA的序列、一个编码细菌scaRNA的序列、W及一个编码与启动子序列可操作结合的 第SRNA的序列，其中编码该第SRNA的该序列的一部分与该scaRNA杂交并且其中编码该 第SRNA的该序列的第二部分与祀序列杂交。
[0028] 在某些实施例中，本披露设及包含W下的分离或重组核酸：一个编码化s9或细菌 化s9mRNA的序列和一个编码连接至编码第SRNA的序列的细菌scaRNA的一部分的序列，该 第SRNA与祀序列杂交W提供RNA嵌合体，其中该RNA嵌合体提供scaRNA和祀向RNA的功 能。
[0029] 在某些实施例中，分离核酸是cDNA。
[0030] 在某些实施例中，Cas9mRNA翻译具有SEQIDNO: 1的化s9或其变体。
[0031] 在某些实施例中，化s9具有一个富含精氨酸的基序、一个RuvC-III基序、W及一 个RuvC-IV基序。
[0032] 在某些实施例中，Cas9mRNA翻译与SEQIDN0:1具有大于约5%、10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%-致性的化39。
[0033] 在某些实施例中，化s9具有一个富含精氨酸的基序，该基序与 MNNRTARR册RRGID服化VK(SEQIDN0:6)具有大于约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、 80%、90%、或 95%的一致性。
[0034] 在某些实施例中，Cas9具有一个RuvC-III基序，该基序与KNIV孤NWQNIKQVLSAK 册LHIPIITESNA阳阳(SEQIDN0:7)具有大于约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、 90%、或95%的一致性。
[00；3日]在某些实施例中，Cas9具有一个RuvC-IV基序，该基序与AKGDKPQASWHLIDAMLAF CIAADEHRNDG(SEQIDN0:8)具有大于约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、90%、或 95%的一致性。
[003引 在某些实施例中，scaRNA包含GUUGUXUAGAUUAUUUGGUAUGUACUUGUGUUAGUUUAAAGUA GXXCUAGAAAAUUCACUUUUAGACCUACUUAUUUU(SEQIDNO: 3)，其中X在每次出现时独立地为任 何核巧酸。
[0037] 在某些实施例中，scaRNA与SEQIDN0:3具有大于约50%、60%、70%、80%、 90%、或95%的一致性。
[0038] 在某些实施例中，RNA的与scaRNA杂交的部分包含GUACCAAAUAAUU(SEQID NO:5)〇
[0039]在某些实施例中，该RNA包含GUACCAAAUAAUU权]。(SEQIDNO: 14)，其中X在每次出 现时独立地为任何核巧酸，并且n为10、20、50、100、200、或更多个核巧酸，通常为少于100、 200、或500个核巧酸。
[0040] 在某些实施例中，本披露设想了包含在此披露的任何核酸序列的重组载体。
[0041] 在某些实施例中，RNA的与祀序列杂交的第二部分，例如技]。大于约10、20、50、 100、200、400、或800 个核巧酸。
[0042] 在某些实施例中，本披露设及在此披露的分离核酸，其进一步编码标志物多肤，如 抗体表位、配体、聚组氨酸、赋予抗生素抗性的蛋白质、分解抗生素的酶如0-内酷胺酶，或 夾光蛋白如绿色夾光蛋白。
[0043] 在某些实施例中，本披露设及包含在此披露的核酸的克隆载体。在某些实施例中， 该克隆载体选自遗传工程化的质粒、瞻菌体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、或病毒。
[0044] 在某些实施例中，本披露设及用在此披露的克隆载体转化的重组细菌细胞。
[0045] 在某些实施例中，本披露设想了制备重组细菌细胞的方法，该些方法包括将在此 披露的克隆载体与细菌细胞混合，其条件使得该克隆载体的核酸包含整合到该细菌细胞的 基因组中的编码序列。
[0046] 在某些实施例中，本披露设及减少祀多肤的翻译的方法，该些方法包括将细菌、原 核、真核、植物、昆虫、或哺乳动物细胞与在此披露的克隆载体混合，其条件使得发生编码序 列的转录、发生化s9的翻译并且形成核酸复合物，其中细菌、原核、真核、植物、昆虫、或哺 乳动物细胞翻译祀多肤，其中第=RNA的与祀RNA(例如rRNA、非编码RNA或编码祀多肤且 翻译祀蛋白的mRNA)杂交的第二部分被减少或祀向RNA被降解。
[0047] 在某些实施例中，祀多肤具有未知的功能。在某些实施例中，本披露设想可形成祀 向RNA和/或细菌的文库和阵列，W确定未知RNA转录物的功能。第=RNA的第二部分可 被工程化，W与具有未知功能的祀RNA序列（例如mRNA、rRNA或非编码RNA)杂交。
[0048] 在某些实施例中，本披露设及编码包含W下的蛋白-核酸复合物的载体；Cas9多 肤、形成双链发夹且包含一部分单链RNA的scaRNA;-部分包含该单链RNA部分的互补序 列的RNA，并且该RNA的第二部分与祀序列例如RNA杂交。在某些实施例中，可将载体转移 到细菌或原核或真核细胞中，其条件使得形成复合物。祀向序列的杂交防止具有未知功能 的RNA转录物例如mRNA执行其预期功能并且对细菌的表型进行分析W确定敲除的功效。在 某些实施例中，第SRNAW及scaRNA和化s9复合物的祀向导致祀向RNA的降解或杂交阻 止翻译。独立地随机筛选大量的具有未知功能的RNA转录物可用于鉴定生长、复制、或其他 性状所必需的RNA转录物。
[0049] 在某些实施例中，本披露设及包含W下的分离蛋白-核酸复合物；化s9或细菌 化s9多肤、形成双链发夹且包含一部分单链RNA的scaRNA;-部分包含该单链RNA部分的 互补序列的RNA，并且该RNA的第二部分与祀序列杂交，其中该单链RNA部分与互补序列杂 交W形成RNA复合物；并且其中化s9或细菌化s9与该RNA复合物结合，W形成蛋白-核酸 复合物。
[0050] 在某些实施例中，本披露设及包含细菌菌株的免疫刺激组合物，该细菌菌株具有 突变的cas9、scaRNA、或tracrRNA基因、或其组合。在某些实施例中，突变处于化s9或细菌 化s9富含精氨酸的基序、RuvC-III基序W及RuvC-IV基序中。在某些实施例中，突变为氨 基酸、多肤或区段的改变或缺失。在某些实施例中，突变是scaRNA或区段的缺失、tracrRNA 或区段的缺失、化s9或区段的缺失、或在scaRNA中产生反向互补序列或在tracrRNA中产 生反向互补序列突变。
[0051] 在某些实施例中，本披露设及免疫受试者W抗细菌菌株的方法，该些方法包括W 有效量向受试者给予在此披露的免疫刺激组合物。
[0052] 在某些实施例中，本披露设想了在此披露的化s9系统在任何原核、真核、人、哺乳 动物、或植物细胞中的使用。
[0