>[0075] 基于LC/MS/MS的初步表征
[0076] 使用装备有ShimadzuHPLC系统的LC/MS/MSAPI2000系统进行不同苔藓素的表 征。从700至1000 amu扫描，对苔藓抑素-lm/z427 [M+Na](图8-1)优化Ql扫描参数。在 图8-2至8-7中呈现了其它馏分的质谱扫描。总共分析了 7个馏分，包括单独的苔藓素和 苔藓素的混合物（表2)。
[0077] 表2 :基于质量匹配每种馏分的苔藓抑素类似物
[0080]讨论:
[0081 ] 对苔藓抑素-1观察到的LC/MS/MS数据显示出927Amu下与[M+NA]对应并且已经 在文献中报道的峰（Manning等，2005)。表3中总结了关于苔藓抑素-1至18的质谱数据。 根据进行的LC/MS/MS分析，确认馏分104和馏分106分别为苔藓抑素-2 (863Amu)和苔藓 抑素-3 (889Amu)。
[0082] 馏分112显示B16质量不与文献中报道的任何苔藓素匹配。馏分102、103和105 显示出与对苔藓抑素-3观察到的质量峰相同的质量峰。馏分102和105在其混合物中均含 有8巧〇-3，这将解释在^：/^3/^3中观察到的911峰。在馏分103中为何看到91认11111还不清 楚；这表明B12可能具有与苔藓抑素-3相同的质量（889Amu)。这受到含B12和Bryo-3的 馏分105仅在911Amu处显示峰的事实支持。在馏分103中观察到的897峰可对应于B10， 尽管其不与文献中报道的任何苔藓抑素质量匹配。馏分102中925Amu处的峰在馏分106 中也观察到。
[0083] 表3 :苔藓抑素-1至18的质谱信息（Manning等，2005)
[0084]
[0085] 苔藓抑素类似物的分离：B16 (98. 5%CP)和B14B(93. 4%CP)
[0086] 从由先前苔藓抑素-1纯化收集的侧馏分纯化苔藓素样化合物，B16和B14B，并且 已经储存在4°C下。苔藓素的紫外光谱与苔藓抑素-1的紫外光谱相同（图9)。
[0087] HPLC监测：
[0088] 纯化期间，在LunaC18(2)柱（250X4. 6mm，10ym)上监测B16 和B14B。以 80% ACNP(经磷酸酸化的乙腈）恒溶剂模式以2mL/min流量进行洗脱。柱温设为30°C。
[0089] 纯化工序和结果:
[0090] 使用两根制备级C18柱（2. 5X2. 5cm，10ym)和一根半制备级PFP柱纯化含B16 和B14B的馏分。使用递增的ACNP浓度以步长梯度进行纯化。监测洗脱，直至每种苔藓素 大体上位于单独的柱上。使用快速梯度，用ACNP剥离柱，并且化验馏分以测定每个峰的浓 度。
[0091] 可使用所述柱体系成功分离苔藓素B16和B14B。C18和PFP柱的使用对于将B16 与B14B分离，和从B14C中部分纯化B14B都是必须的。峰标记的B14C是与B14B共洗脱 的另一种苔藓素，并且在以70%ACNP分析时可更好地监测。通过向含苔藓素的馏分中添 加MeOH可能使B16和B14B/C结晶。总共收集到212mg、98. 5%CP的B16晶体。总共回收 108mg、93. 4%CP的B14B/C并储存用于进一步纯化。随后将B14B/C分离成B14B和B14C。 通过LC/MS/MS再次分析纯化的苔藓素。表4中总结了结果。
[0092] 表4 :基于质量匹配对每种馏分的纯化苔藓抑素类似物的LC/MS/MS分析
[0093]
[0094] 纯化苔藓素的牛物活件:
[0095] 图10中显示IO-9M的纯化苔藓素增强了SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞中的a-分 泌酶活性。显示B3、B14B和B16比苔藓抑素-1提高了a-分泌酶的生成。
[0096] 图11中显示BlO比苔藓抑素-1提高了PKC-e的生成。图12中显示BlO比苔藓 抑素-1提高了PKC-S的生成。图13中显示BlO比苔藓抑素-1提高了PKC-a的生成。
[0097] NMR和结构表征：
[0098] 通过其NMR1H和13C共振和连通性（HSQC和HMBC光谱）将三种变体与苔藓抑素1 和苔藓抑素3作比较。三种变体显然全部在苔藓抑素3的C22处具有闭环，并且具有类似 的Rl和R3侧链（OAc和8-碳2,4-烯）。相对于苔藓抑素3,变化为：
[0099] BlO:NMR显示从C18上失去一个甲基，与质量差匹配：预测值C45H62O17= 874. 4(单 一同位素）；观测值B10874. 4。图14中描绘了BlO的假定结构。
[0100] B12似乎为立体异构体：在19-24环附近的许多质子在化学位移上具有适度变化； 但是连通性显示出与苔藓抑素3相同的共价结构，并且其具有与苔藓抑素3相同的质量 (C46H64O17= 888.4)。如果闭环机制立体选择性不完美，则最可能的位点在C22处。虽然在 其它苔藓抑素中未见到这些变化，但是相邻位点（19、20或23)的反转也可解释NMR变化。 图15中描绘了B12的假定结构。
[0101] B16 中，26-0H已经变成酮。这个变化是在B16(C46H62017= 886. 4)和Bry〇-3(888. 4) 之间观察到2Da质量差的原因。已知苔藓抑素-3 26-酮（Schaufelberger1991)。
[0102] 通过图16-18的NMR图谱中列出的NMR数据提出了这些结构。图16描绘了苔藓 抑素-3的NMR图谱。图17描绘了BlO的NMR图谱。图18描绘了在苔藓抑素-3的NMR图 谱上重叠的B12的NMR图谱。
[0103] 因此，我们已经根据我们当前对制备和使用这些化合物的最佳模式的理解公开了 本发明的实施方案。本领域中的技术人员将易于理解此类优选实施方案易于改变和修改， 因此本发明不应限于准确细节，但应涵盖所附权利要求的主题及其等效物。
【主权项】
1. 第一苔藓素组合物，其分子量为约896-898Amu (质量+钠）和873-875Amu (单一同 位素质量），纯度为约50%至晶体成型纯度。2. 根据权利要求1所述的第一苔藓素组合物，其测量的质量+钠为897. 2Amu并且测量 的单一同位素质量为874. 2Amu。3. 第二苔藓素组合物，其分子量为约910-912Amu (质量+钠）和888-890Amu(单一同 位素质量），纯度为约50%至晶体成型纯度。4. 根据权利要求3所述的第二苔藓素组合物，其测量的质量+钠为911. 5Amu并且测量 的单一同位素质量为888. 9Amu。5. 第三苔藓素组合物，其分子量为约868-870Amu (质量+钠）和846-848Amu (单一同 位素质量），纯度为约50%至晶体成型纯度。6. 根据权利要求5所述的第二苔藓素组合物，其测量的质量+钠为869. 5Amu并且测量 的单一同位素质量为846. 6Amu。7. 第四苔藓素组合物，其分子量为约895-897Amu (质量+钠）和872-874Amu(单一同 位素质量），纯度为约50%至晶体成型纯度。8. 根据权利要求7所述的第四苔藓素组合物，其测量的质量+钠为895. 5Amu并且测量 的单一同位素质量为872. 6Amu。9. 一种制备苔藓素组合物的方法，包括以下步骤：从苔藓素来源分离苔藓素组合物并 将所述苔藓素组合物纯化至50%的纯度和晶体成型纯度，所述苔藓素组合物选自由第一苔 藓素、第二苔藓素、第三苔藓素和第四苔藓素组成的苔藓素组。10. -种治疗对苔藓素组合物有反应的疾病的方法，包括施用有效量的选自第一苔藓 素、第二苔藓素、第三苔藓素和第四苔藓素的苔藓素组合物的步骤。
【专利摘要】本发明的实施方案描写了新型苔藓素组合物、制备方法和治疗疾病的方法。
【IPC分类】C07D321/00
【公开号】CN105008342
【申请号】CN201380069328
【发明人】T.P.卡斯托尔
【申请人】阿菲欧斯公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2013年11月26日
【公告号】EP2925315A2, US20150291616, WO2014085491A2, WO2014085491A3