长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种菌种及其制备方法和应用，具体说是一种长链二元酸生产菌株及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 长链二元酸是重要化工原料，具有极其广泛的用途，能够合成香料、特种尼龙、高 级润滑油等一系列高附加值的化学品。长链二元酸可应用在军用领域、航空航天器的涂层、 管路、汽车的表面涂层及油管等；在民用领域，可应用于汽车、日化香料、工程塑料、尼龙行 业等十多个高新科技行业，可开发出更多的下游产业，形成新兴的产业链。
[0003] 以往，长链二元酸采用化学合成法生产，其专利技术被国外所拥有。化学合成法生 产长链二元酸，不仅产品种类单一，且合成工艺复杂、成本高、污染大。我国是世界上唯一能 够采用微生物发酵技术实现多种长链二元酸大规模工业化生产的国家。此前，我国二元酸 生产菌种的改良均是通过不同方式诱变等传统育方法实现的。传统育种方法具有很大随机 性，筛选复杂。通过传统育种的方法已经很难进一步提高菌株的性能。当前长链二元酸工 业化生产过程中仍有许多瓶颈问题，如底物转化率有待提高、生产能耗非常巨大等等。
[0004] 代谢工程技术可以在基因水平上有针对性的进行菌种分子改造，获得性能更加优 良的新菌株。如图1、图2所示，二元酸代谢途径主要包括ω-氧化途径和β-氧化途径， 其中前者为二元酸合成途径，后者涉及二元酸降解途径。代谢工程的目的是通过分子改造 手段来提高ω-氧化活性，并降低β-氧化活性。国际上，Henkel公司（后来的Cognis公 司）有专利报道（US005254466A)，用基因敲除方式来优化二元酸生产菌株，依次将4个POX 基因敲除，达到完全阻断β-氧化，使底物转化率提高为100%。在此基础上，该公司进一 步通过代谢工程手段共表达CYP单加氧酶和还原酶，以达到增强ω -氧化的目的，产量提高 30% (World Patent W0/91/06660)。
[0005] 但是利用该菌株进行批式发酵实验，其工艺仍无法与当时其他二元酸生产工艺竞 争，而最终没有进行规模化生产。Henkel公司对菌种进行分子改造所使用的筛选标记为尿 嘧啶营养缺陷型。Henkel公司发明专利的缺点为：1、出发菌株不是工业化生产所用的高产 菌株；2、发酵法生产长链二元酸所用的假丝酵母为二倍体，即每个细胞具有两套染色体，每 个基因都有对应的等位基因，而且催化每步体内生化反应的酶往往由多个基因编码。因此， 通过代谢工程手段来增强或减弱某个体内生化反应的活性，需要对编码该酶的关键基因进 行分子改造才有显著效果。否则，改造后效果也不会显著。
【发明内容】
[0006] 本发明就是为了解决现有菌株生产长链二元酸效果不显著的技术问题，提供一种 生产效率高的长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用。
[0007] 为此，本发明提供一种长链二元酸生产菌株，其分类命名为假丝酵母菌（Candida sp.)TDTC027,所述菌株于2014年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所；其保藏编号为=CGMCC No. 8931。
[0008] 本发明中，长链二元酸生产菌株过氧化氢酶等位基因 CandidaA05093和 CandidaA09561之一的启动子被强启动子替换，所述的过氧化氢酶等位基因的碱基序列如 序列表中的序列8和序列9所示，过氧化氢酶基因为该菌株基因组中编码该酶的多个基因 中对于长链二元酸生产最为关键的一个。
[0009] 本发明同时提供一种长链二元酸生产菌株的制备方法，其包括如下步骤：（1)准 备引物Prol、Pr〇2、Pr〇3和Pro-4 ; (2)准备长链二元酸生产菌感受态细胞；（3)使用步骤 (1)中的引物进行扩增分别得到筛选标记Satl基因片段（引物Prol和Pr〇2)和强启动子 片段（引物Pro3和Pro4)，再经过一轮重叠 PCR将两个片段连接起来，再将此重叠 PCR扩增 的产物通过同源重组替换过氧化氢酶等位基因的原始启动子，达到增强过氧化氢酶基因表 达的目的，所述的过氧化氢酶等位基因的碱基序列如序列表中的序列8和序列9所示；(4) 通过PCR扩增、纯化、电转、筛选、鉴定，得到本发明的长链二元酸生产菌株。
[0010] 优选地，本发明中长链二元酸生产菌株的制备方法，筛选步骤中使用的筛选标记 为cIonNAT抗性。
[0011] 优选地，长链二元酸生产菌株的制备方法，步骤（2)中的长链二元酸生产菌株假 丝酵母（Candida sp. ) DC12〇
[0012] 本发明同时提供长链二元酸生产菌株在生产长链二元酸中的应用。
[0013] 优选地，发酵结束后，将发酵液加热至70~80°C ;再将pH调至9~
[0014] 9. 5,除去菌体沉淀，保留上清；脱色，温度保持在70~90°C，得到滤清液，用酸酸 化至pH2. 5, 70~90°C保温，冷却，离心或压滤，水洗，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到 长链二元酸。
[0015] 本发明中的长链二元酸是指含有十个以上碳原子的直链二羧酸，是一种重要的 精细化工中间原料，特别是十二碳二元酸（DC12)、十四碳二元酸（DC14)、十六碳二元酸 (DC16)和十八碳二元酸（DC18)。
[0016] 本发明的有益效果是，为了突破生产菌种遗传改造的瓶颈，本发明通过解析生产 菌株的基因组学和转录组学特征，分析ω-氧化和β-氧化代谢途径，在基因组全局水平 上确立了二元酸代谢相关的一些关键靶位点，再通过代谢工程手段对这些位点进行分子改 造，并经过发酵实验验证，获得了性能更加优良的菌株。本发明的TDTC027菌株（保藏号： CGMCC No. 8931)，相比DC12菌株，发酵月桂酸甲酯产酸量显著提高，为规模化生产带来有益 效果。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明涉及到的长链二元酸合成相关ω-氧化代谢途径；
[0018] 图2为本发明涉及到的长链二元酸降解相关β -氧化代谢途径；
[0019] 图3为本发明涉及到的启动子替换流程图；
[0020] 图4为HPLC分析DC12发酵生产的长链二元酸；
[0021] 图5为HPLC分析TDTC027发酵生产的长链二元酸。
[0022] 本发明的长链二元酸生产菌株，其分类命名为假丝酵母菌（Candida sp.) TDTC027 ;其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地 址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2014年3 月18日，保藏号编号为：CGMCC No. 8931。
【具体实施方式】
[0023] 本发明序列表中序列的名称如下：序列I :Prol ;序列2 :Pro2 ;序列3 :Pro3 ;序列 4 :Pro4 ;序列 5 :Pro_U ;序列 6 :Pro_D ;序列 7 :CYP promoter ;序列 8 :CandidaA05093 ;序列 9 ：CandidaA09561〇
[0024] 以下实施例中观察到的菌落及菌体形态归纳如下：
[0025] 固体培养基平板上，菌落奶酪状，表面光滑，乳白色，饱满凸起，菌落直径约为2mm。 酵母样单细胞，大小约为10x6 μm。大多情况下，以酵母样单细胞形式，同时会有假菌丝体 形成，如在某些生长阶段或某种外界条件刺激下，假菌丝比例会显著增加。
[0026] 以下实施例中使用了下面所列的培养基：
[0027] 1、YPD培养基，其配方为：1%的酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，若制固体培养基， 加入2%琼脂粉。上述百分比为质量体积百分比，即每100毫升培养基所需该组分的克数。 若要添加抗生素，液体培养基在使用时加入至相应终浓度。固体培养基在高压灭菌后冷却 至50摄氏度左右时，加入抗生素至相应终浓度，混匀后立刻倒如无菌的培养皿中，待凝固 后倒置，放于4摄氏度冰箱，两周内使用。
[0028] 2、种子培养基的配方：酵母膏1~8g/L，玉米楽；1~8g/L，鹿糖5~25g/L， KH2P044~12g/L，尿素0· 5~4g/L，重蜡40~70g/L，121°C灭菌30分钟。其中，蔗糖和尿 素分开单独ll〇°C灭菌20分钟，灭菌后再合并混匀。
[0029] 3、发酵罐培养基配方：酵母膏1~8g/L，玉米浆1~8g/L，蔗糖5~30g/L， KH2P044 ~15g/L，尿素 0· 5 ~4g/L，KN035 ~15g/L，NaC10. 5 ~2. 5g/L，121Γ灭菌 30