分钟。 其中，蔗糖和尿素分开单独灭菌，ll〇°C灭菌20分钟，灭菌后再合并混匀。另外配制75%葡 萄糖溶液，105 °C灭菌20分钟，发酵初期进行流加。
[0030] 以下实施例中使用了下面所列的菌体培养及发酵液处理方式：
[0031] 1、平板培养：在YH)平板上划线或涂布后倒置于30°C培养箱内，2-3天即可观察到 大而饱满的乳白色菌落形成。
[0032] 2、摇床培养：平板上接种单菌落至液体培养基中，或从液体培养基转接过来，30°C 摇床培养，转速保持在220转/分钟。
[0033] 3、发酵罐培养：可以比较实时精确控制发酵条件，如补料控制、pH控制、溶氧控制 和通气搅拌强度控制等等。第一阶段，发酵液pH控制在5~6. 8,同时流加葡萄糖溶液，为 菌体生长阶段；第二阶段，发酵液pH控制在7. 0~7. 8,同时流加底物（烷烃、脂肪酸或脂 肪酸衍生物，如甲酯或乙酯等），以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不 产菌体，根据发酵情况继续流加底物（烷烃、脂肪酸或脂肪酸衍生物，如甲酯或乙酯等）。整 个发酵过程用IOM NaOH溶液自动流加控制pH，同时通过转速的调整使溶解氧保持在20~ 40%〇
[0034] 4、发酵液处理：发酵结束后，将发酵液加热至70~80°C，并维持60分钟；再加入 IOM NaOH将pH调至9~9. 5,用管式离心机或压滤除去菌体沉淀，保留上清；加入适量活性 炭脱色，温度保持在70~90°C，保温时间为60分钟；除去活性炭后，得到滤清液，用浓盐酸 或浓硫酸连续酸化至PH2. 5, 70~90°C保温2小时，冷却至30°C，离心或压滤，清水洗一遍， 清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到白色二元酸。
[0035] 实施例1 :菌株代谢工程改造
[0036] 1)基因组测序
[0037] 利用宝生物工程有限公司的基因组提取试剂盒（Yeast DNAiso Kit)制备长链二 元酸生产菌株假丝酵母基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。基因组DNA再经过 文库构建、新一代测序技术测序分析和数据组装等步骤。通过基因组注释和数据分析，获得 了生产菌株在二元酸生产相关的基因信息，挖掘了该菌在ω-氧化和β-氧化代谢途径相 关基因的编码序列。对于酵母，β-氧化主要发在在过氧化物酶体内，特别是长链脂肪酸的 β-氧化，只发生于过氧化物酶体这种细胞器里。在ω-氧化代谢途径中，烷烃经过CYP单 加氧酶、脂肪醇氧化酶及脂肪醛脱氢酶三步酶催化反应，烷烃的一个末端被氧化成羧基，生 成脂肪酸。脂肪酸再经过一轮ω-氧化过程（同样的三步酶催化反应），烷烃的两个末端都 被氧化成羧基，生成二元酸。ω -氧化三步反应过程中的前两步反应均产生过氧化氢这种副 产物。而如果过氧化氢在体内堆积的话，对于菌体是有毒性的。为了保证ω-氧化持续保持 高活性，必须有效清除副产物过氧化氢。一个比较有效的侧略就是增强过氧化氢酶的表达， 及时清除过氧化氢。而增强过氧化氢酶表达可以通过增强启动子活性来实现。序列分析发 现，二元酸生产菌株基因组含有两个过氧化氢酶（catalase)基因，分别为CandidaA05093 和CandidaA09561，编码区长度均为1458bp，序列相似性高达98%，上下游区域序列也高度 相似，因而可以判断是一对等位基因。
[0038] 2)转录组测序
[0039] 利用德国凯杰公司的RNA提取试剂盒（RNeasy Mini Kit)制备长链二元酸生产菌 株假丝酵母的总RNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。得到的总RNA再经过文库构建、转 录组测序及表达量分析。通过转录组数据分析，CandidaA05093和Candida09561这对过氧 化氢酶等位基因转录水平分别为5125. 7和5591. 3RPKM。而且分析表明，CandidaA06129 (编 码CYP单加氧酶）的转录水平为20503. 5RPKM，为全部基因里转录水平最高的一个。本发明 将过氧化氢酶基因的启动子替换为CandidaA06129的启动子，以达到增强过氧化氢酶基因 表达的目的。这里，RPKM是基因表达量的一个计算方法，表示Reads Per Kb Per Million Reads。其计算公式为
[0041] 设RPKM(A)为基因 A的表达量，则C为唯一比对到基因 A的reads数，N为唯一比 对到参考基因的总reads数，L为基因 A编码区的碱基数。RPKM法能消除基因长度和测序 量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可以直接用于比较基因表达差异。
[0042] 由于ω-氧化是长链二元酸合成相关的代谢途径，菌种改造的目的是增强ω-氧 化活性，以提高菌株合成二元酸的能力。由于ω-氧化产生大量的过氧化氢，过氧化氢对菌 体有毒性作用。过氧化氢酶能够水解过氧化氢，生成水和氧气。本发明通过强启动子替换 来增强氧化氢酶的表达水平，达到有效清除过氧化氢的目的，保证ω -氧化过程保持高效 进行，从而达到更加有效合成二元酸的效果。
[0043] 3)启动子替换实验流程如图3所示。引物设计原则，同源臂和检测引物的设计都 选择在CandidaA05093和Candida09561编码区上游启动子序列及编码区起始区域的比对 中完全相同的区域，从而达到两个等位基因启动子替换和检测具有同等的概率。使用Prol 和Pr〇2为引物，进行PCR扩增得到Sat 1基因片段，包括启动子和终止子。使用Pr〇3和Pr〇4 为引物，二元酸生产菌株基因组DNA为模版，进行PCR扩增得到CandidaA06129的启动子 (强启动子）片段。再以上述扩增到的Satl基因片段和强启动子片段为模版，以Prol和 Pro4为引物，经过一轮重叠 PCR将两个片段连接起来，再将此重叠 PCR扩增的产物整合到尿 嘧啶营养缺陷型菌株基因组里。其中引物Prol和Pr〇4的5'端为同源臂序列，对应于过氧 化氢酶基因启动子的上游和下游序列。这样，经过重叠 PCR扩增后得到的DNA片段，两头分 别带上下游同源臂，中间Satl基因和强启动子。
[0044] 扩增的DNA片段经纯化后进行电转化导入菌体细胞内，DNA片段的上下游同源臂 与菌体染色体上的靶位点发生双交换，达到启动子替换的目的。由于这种双交换是小概率 事件，需要建立方法来进行筛选。这里所使用到的抗性基因是Satl，编码诺尔斯菌素乙酰 转移酶。二元酸生产菌株对诺尔斯菌素（又叫clonNAT或NTC)这种药物敏感，在含诺尔斯 菌素的平板上不能生长，而表达该酶后菌体能够分解诺尔斯菌素，避免致死效应。抗性筛选 标记只有整合到染色体上去才能得到表达，发挥作用，使得菌体能够在含抗性的培养基平 板上生长，并形成菌落。同时对具有抗性的菌落，进行纯化和验证。
[0045] 验证时，使用到一对检测引物Pro-U和Pro-D，分别与靶位点的上游和下游区域配 对。如果没有同源重组发生，通过这基因组DNA为模版扩增出来的片段在长度上是一样的， 在琼脂糖电泳中只能观察到一条带。如果重叠 PCR扩增的片段通过同源重组整合到靶位 点，那么经过扩增得到的片段长度就发生变化，在琼脂糖电泳中可以观察到两条带。经过验 证的菌株，再通过发酵实验验证代谢工程改造获得新菌株在二元酸生产方面是否有性能上 的优势。
[0048] 其中，质粒 pSFS2,参考文献为 Gene (2004) 341:119 - 127, GeneBank 数据库的登 录号为：AY524979,来源于中国科学院微生物所。使用Prol和Pro2为引物1和引物2,质 粒PSFS2为模版，进行PCR扩增得到Satl基因，包括启动子和终止子。使用Pr〇3和Pr〇4 为引物1和引物2,二元酸生产菌株基因组DNA为模版，进行PCR扩增得到CYP单加氧酶基 因（CandidaA06129)的强启动子。再以上述扩增到的Satl基因和强启动子片段为模版，以 Prol和Pro4为引物，经过一轮重叠 PCR将两个片段连接起来。DNA聚合酶是宝生物工程有 限公司的Pyrobest DNA聚合酶，或者是NEB公司的Phusion DNA聚合酶，活性单位均为5U/ μ 1〇
[0049] PCR循环条件为：
[0050] 94度2分钟 （预变性阶段）
[0051] 94度20秒，58度20秒，72度1~6分钟（30个循环扩增阶段，Ikb/分钟）
[0052] 72度10分钟 （最后延伸阶段）
[0053] 5) DNA 纯化
[0054] 重叠 PCR反应结束后，取5 μ 1上述PCR样品进行琼脂糖电泳检测，证明扩增所得 的DNA片段大小与预计的一样，而且没有杂带，进行两步纯化和浓缩，为后面的转化准备 DNA样品。
[0055] 第一步是利用PC