一种甘蔗无载体框架转基因方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及技术领域涉及植物遗传转化领域，具体涉及甘蔗无载体框架转基因方 法。
【背景技术】
[0002] 植物遗传转化是研究外源目的基因功能和开发转基因植物的有效途径，是开展植 物学研究的基础手段之一。近年来，随着转基因植物的商业化种植，转基因作物品种和种植 面积逐年增加，产生了巨大的经济效益和环境效益。但是，消费者对转基因作物的安全性要 求也越来越高，转化背景简单的转基因植物和高效快速的转基因技术是研究的发展趋势。
[0003] 甘蔗是一种重要的糖料经济作物，广泛种植于热带、亚热带地区，甘蔗糖占全球食 糖总量的70%以上。同时，甘蔗具有高光合效率、高生物产量的特点，是生产乙醇的最佳能 源作物。甘蔗属于日中性植物，开花难，同时甘蔗在生产上通过无性繁殖，相比其它转基因 甘蔗具有较高的生物安全性，属于转基因安全I类植物，具有良好的商业化种植前景。
[0004] 基因枪转化技术目前已经广泛应用于植物转基因研究，具有适应性广，效率高的 特点。目前常规的甘蔗转基因所用的外源基因材料多为含有目的基因的载体，这导致大量 载体序列也插入到甘蔗基因组中，导致效率低下，同时也导致转基因甘蔗的遗传背景较为 复杂。特别是目前甘蔗基因组还没有完成，导致确定目的基因的插入位点无法完成。目前有 通过如pCambial300系列载体将外源基因导入甘蔗的方法报道，如专利CN201210462236. 8 公开的一种抗螟虫（BT)和抗除草剂（Bar)共价外源基团导入甘蔗的方法，由于基因枪转化 是随机的，避免了载体序列的插入，导致插入片段的随机性和复杂性，造成转化效率低。
【发明内容】
[0005] 为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种无载体框架的甘蔗无载体框 架转基因方法，可利用该方法获得一种转基因甘蔗。
[0006] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] -种甘蔗无载体框架转基因方法，包括以下步骤：
[0008] 1)质粒提取：对含有bar基因的大肠杆菌单菌落进行培养，提取含有bar基因的 质粒；
[0009] 2)Bar基因表达盒的制备：采用核酸内切酶Hind III和Xho I酶切步骤1)获得的 含有bar基因的质粒，得酶切产物；将酶切产物进行电泳纯化，收集含有启动子、bar基因和 终止子的Bar基因表达盒；
[0010] 3)基因枪转化：将步骤2)获得的Bar基因表达盒制备DNA微弹，用装载有DNA微 弹的基因枪轰击甘蔗愈伤组织，对轰击后的愈伤组织进行培养；
[0011] 4)抗性筛选：使用除草剂进行抗性筛选，再生培养，得到转基因植株。
[0012] 作为优选，步骤2)中，取步骤1)获得的含有bar基因的质粒，每lOiig质粒加入 10*buffer 10yL、HindIII酶 2yL 和Xho I 酶2yL，加入双蒸水定容至 100yL，37°C 过夜， 得酶切产物。
[0013] 作为优选，步骤2)中以琼脂糖凝胶为凝胶介质，以核酸电泳缓冲液10XTAE Buffer为电泳缓冲液，进行电泳纯化。
[0014] 作为优选，步骤3)中，使bar基因沉淀到金粉微粒载体上，制备金粉悬浮液，转移 至载物膜上，制得DNA微弹。
[0015] 作为优选，步骤3)中，轰击条件为：基因枪样品室的真空度为20mM Pa，轰击压力 位llOOpsi，射程为9cm，轰击1次。
[0016] 作为优选，步骤3)中，愈伤组织采用高渗培养基进行培养，所述高渗培养基为含 有 0.2mol/L Sorbitol 和 0.2mol/L Mannitol、lmg/L 2,4-D 和 5.5g/L 琼脂粉的 MS 培养基。
[0017] 作为优选，步骤4)中，采用选择培养基进行抗性筛选，所述选择培养基为含有 3mg/L2, 4 一 D、5mg/L草丁膦、5. 5g/L琼脂粉的MS培养基，所述选择培养基的pH值为5. 8。
[0018] 作为优选，步骤4)中，使用分化培养基后和生根培养基进行再生培养，所述分化 培养基为含有3mg/L 6-BA、5mg/L草丁膦、5. Og/L琼脂粉的MS培养基，所述分化培养基的 pH值为5. 8 ;所述生根培养基为含有3mg/L NAA、5mg/L草丁膦、5. 0g/L琼脂粉的MS培养基， 所述生根培养基的pH值为5. 8。
[0019] 作为优选，步骤4)后，还包括一 PCR检测步骤，采用如下引物序列：
[0020] 上游引物 SEQ ID No. 1 :5,-ACCATCGTCAACCACTACAT-3' ；
[0021] 下游引物 SEQ ID No. 2 :5' -AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。
[0022] 作为优选，PCR 检测反应体系：模板 DNA 50-100ng，lOXBuffer 1. 5 y L，lOmmol/ L dNTP 0? 35 y L, lOmmol/L 上游引物 0? 35 y L, lOmmol/L 下游引物 0? 35 y L, 25mmol/L MgC121. 0 y L, Taq 酶（5U/ y L) 0? 2 y L,加 ddH20 至 15 y L ;
[0023] PCR 反应条件：95°C预变性 3min ;95°C 30sec, 60°C 40sec, 72°C 40sec, 35 个循环； 72°C 延伸 10min，4°C 保存。
[0024] 本发明相比起现在有技术，有以下技术效果：
[0025] 1.本发明采用含有目的基因的表达盒，去掉无用的载体序列直接采用目的外源基 因转入甘蔗受体，减少无用序列插入的机会，提高了目的基因的插入改良，有效提高了转化 效率；
[0026]2.本发明提供的转基因方法，外源基因的背景清晰，更有利于插入位点的确定，转 基因过程更加可控；
[0027] 3.本发明制备了 Bar基因的表达盒，利用基因枪对甘蔗进行转化，获得了含有Bar 的抗除草剂转基因甘蔗，提供了一种更加经济可行的获得抗除草剂甘蔗的转基因方法；
[0028] 4.本发明提供的甘蔗无载体框架转基因方法，操作方便，不需要操作人员掌握大 量的操作技能，适合大规模的商业化转基因甘蔗的批量生产；
[0029] 5.本发明提供的甘蔗无载体框架转基因方法，不仅适用于将Bar基因导入甘蔗植 株，还适用于将其它除草剂基因导入甘蔗植株。
[0030] 下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0031] 图1为Bar基因表达盒不意图；
[0032] 图2为酶切产物电泳图；
[0033] 图3为基因枪转化后的愈伤组织图；
[0034] 图4为再生植株；
[0035] 图5为移栽成活的转基因植株；
[0036] 图6为再生植株的PCR检测电泳图，其中1号为阳性对照；2号为阴性对照；3-25 号为转基因植株。
【具体实施方式】
[0037] 以下【具体实施方式】中，所用试剂或仪器如无特殊说明，均视为市售。
[0038] 本发明提供一种甘蔗无载体框架转基因方法，包括以下步骤：
[0039] 1)质粒提取：对含有bar基因的大肠杆菌单菌落进行培养，提取含有bar基因的 质粒；
[0040] 2)Bar基因表达盒的制备：采用核酸内切酶Hind III和Xho I酶切步骤1)获得的 含有bar基因的质粒，得酶切产物；将酶切产物进行电泳纯化，收集含有启动子、bar基因目 的片段和终止子的Bar基因表达盒；
[0041] 该Bar基因的表达盒可用于制备DNA微弹，再利用基因枪对甘蔗进行转化；
[0042] 3)基因枪转化：将步骤2)获得的Bar基因表达盒制备DNA微弹，用装载有DNA微 弹的基因枪轰击甘蔗愈伤组织，对轰击后的愈伤组织进行培养；
[0043] 4)抗性筛选：使用除草剂进行抗性筛选，再生培养，得到转基因植株。
[0044] 以下实施例中，所采用的甘蔗基因型为甘蔗品种新台糖20号、新台糖22号、粵糖 00-236。本发明中bar基因为除草剂基因。
[0045] 以下实施例中，所述Sorbitol为山梨（糖）醇，所述Mannitol为甘露醇。
[0046] 实施例1 :
[0047] -种甘蔗无载体框架转基因方法，包括以下步骤：
[0048] 1)质粒的提取
[0049] 平板挑取含有Bar的大肠杆菌的单菌落，接种于含抗生素的LB液体培养基中， 37 °C摇床过夜，收集菌体，获得含有bar基因的质粒；
[0050] 具体质粒提取方法可参见《植物基因工程原理与技术》，王关林、方宏筠等编。
[0051] 2) Bar基因表达盒的制备
[0052] a)取步骤1)获得的含有bar基因的质粒10 y g，加入10*buffer 10 y L、HindIII 酶2 y L和Xho I酶2 y L，加入双蒸水定容至100 y L，37°C过夜，得酶切产物；
[0053] b)取酶切产物，在10XTAE电泳缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳，当溴酚蓝迀移至 5cm-8cm时，切下bar基因目的片段的胶块，收集含有启动子、bar基因目的片段和终止子的 Bar基因表达盒，调整bar基因目的片段的浓度为100ng/yL，-20°C储存备用；图1为Bar 基因表达盒示意图；图2为酶切产物电泳图。
[0054] 3)基因枪转化
[0055] i) DNA微弹的制备：