取4°C保存的60mg/mL的金粉悬浮液100 y L，从步骤2)获得 的Bar基因表达盒内取样20 y L，依次加入2. 5mol/L的CaCl2100 y L和0? lmol/L的亚精胺 40 y L，振荡5min，冰上静置10min，使bar基因目的片段沉淀到金粉微粒载体上，12, OOOrpm 离心5s，弃上清液，加180 y L 70%乙醇漂洗沉淀，冰上静置lOmin，12, OOOrpm离心5s，弃上 清，加180 y L无水乙醇悬浮沉淀，冰上静置lOmin，12, OOOrpm离心5s，弃上清，加80 y L无 水乙醇重新悬浮沉淀，制得金粉悬浮液，取6 y L制备好的金粉悬浮液移至载物膜上，制得 DNA微弹，晾干备用；
[0056] ii)轰击前愈伤组织的培养：挑取色泽淡黄、致密、颗粒状、干燥的胚性愈伤组织 为转化受体，转移到高渗培养基上暗培养8h，其中高渗培养基为含有0. 2mol/L Sorbitol、 0? 2mol/L Mannitol、lmg/L 2, 4-D 和 5. 5g/L 琼脂粉的 MS 培养基；
[0057] iii)轰击：将DNA微弹装载至Bio-Rad PDS-1000/He型基因枪，对上述愈伤组织进 行轰击，轰击条件为：基因枪样品室的真空度为20mM Pa，轰击压力位llOOpsi，射程为9cm， 轰击1次；
[0058] iv)轰击后愈伤组织的培养：轰击后的愈伤组织在原高渗培养基上继续暗培养 16~18h后，转移到继代培养基上，恢复培养3d，得愈伤组织材料，图3为基因枪转化后的 愈伤组织图；
[0059] 4)抗性筛选
[0060] I)选择性培养：将步骤3步骤iv)获得的愈伤组织材料移到含有除草剂草丁膦的 选择培养基上，培养4周；
[0061] 在培养期间，愈伤组织材料的植体绝大多数部分褐化死亡，有少数瘤状愈伤组织 从褐化的叶片表面长出，挑选瘤状愈伤组织继续在选择培养基上暗培养2次，得到抗性愈 伤组织；
[0062] 其中选择培养基为含有3mg/L2, 4-D、5mg/L草丁膦和5. 5g/L琼脂粉的MS培养基， 选择培养基的pH值为5. 8 ;
[0063]II)分化培养：取步骤I)获得的抗性愈伤组织，转移到分化培养基上进行培养，培 养至抗性愈伤组织的苗高2-3cm ;
[0064]其中，分化培养基为含有3mg/L 6-BA、5mg/L草丁膦、5. 0g/L琼脂粉的MS培养基， 分化培养基的pH值为5. 8 ;
[0065]III)生根培养：切取步骤II)的抗性愈伤组织幼苗，接到生根培养基进行生根诱 导；4周后，可见植株高约6cm，下部出现长约2cm的根，再生植株见图4 ;
[0066]其中，生根培养基为含有3mg/L NAA、5mg/L草丁膦、5. 0g/L琼脂粉的MS培养基，生 根培养基的pH值为5. 8 ;
[0067]IV)再生培养：炼苗1周，洗净植株根部的培养基后植株移栽到育苗盘中，其中育 苗盘中基质为园土和泥炭土按1 :1混合得到的培养土，图5为移栽成活的转基因植株。
[0068] 实施例2 :再牛棺株的PCR检测
[0069] 取实施例1步骤4)获得的再生植株的叶片，采用微量法提取总DNA进行PCR扩增， PCR扩增采用SEQIDNo.1所述的上游引物，采用SEQIDNo. 2所述的上游引物；
[0070] SEQ ID No. 1 :5,-ACCATCGTCAACCACTACAT-3，；
[0071] SEQ ID No. 2 :5,-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3，；
[0072] PCR 反应体系：模板 DNA 50-100ng，lOXBuffer 1. 5 y L，10mmol/L dNTPO. 35 y L, lOmmol/L 上游引物 0? 35 y L, lOmmol/L 下游引物 0? 35 y L, 25mmol/L MgC121. 0 y L, Taq 酶（5U/ y L) 0? 2 y L,加 ddH20 至 15 y L ;
[0073] PCR 反应条件：95°C预变性 3min ;95°C 30sec, 60°C 40sec, 72°C 40sec, 35 个循环； 72°C 延伸 10min，4°C 保存；
[0074] PCR扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测，图6为再生植株的PCR检测电泳图，1 号为阳性对照，2为阴性对照，3-25号为转基因植株，其中，3-9号为新台糖20号；11-12、 14-19号为新台新台糖22号；23-25号为新台粵糖00-236 ;从图6可知，本发明提供的甘蔗 无载体框架转基因方法的转化率高。
[0075] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围， 本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所 要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种甘蔗无载体框架转基因方法，包括以下步骤： 1) 质粒提取：对含有bar基因的大肠杆菌单菌落进行培养，提取含有bar基因的质粒； 2. Bar基因表达盒的制备：采用核酸内切酶Hind III和Xho I酶切步骤1)获得的含有 bar基因的质粒，得酶切产物；将酶切产物进行电泳纯化，收集含有启动子、bar基因和终止 子的Bar基因表达盒； 3) 基因枪转化：将步骤2)获得的Bar基因表达盒制备DNA微弹，用装载有DNA微弹的 基因枪轰击甘蔗愈伤组织，对轰击后的愈伤组织进行培养； 4) 抗性筛选：使用除草剂进行抗性筛选，再生培养，得到转基因植株。2. 如权利要求1所述的甘蔗无载体框架转基因方法，其特征在于，步骤2)中，取步骤 1)获得的含有bar基因的质粒，每10 y g质粒加入10*buffer 10 y L、Hind III酶2 y L和 Xho I酶2yL，加入双蒸水定容至100yL，37°C过夜，得酶切产物。3. 如权利要求1所述的甘蔗无载体框架转基因方法，其特征在于，步骤2)中以琼脂糖 凝胶为凝胶介质，以核酸电泳缓冲液IOXTAE Buffer为电泳缓冲液，进行电泳纯化。4. 如权利要求1所述的甘鹿无载体框架转基因方法，其特征在于，步骤3)中，使bar基 因沉淀到金粉微粒载体上，制备金粉悬浮液，转移至载物膜上，制得DNA微弹。5. 如权利要求1所述的甘蔗无载体框架转基因方法，其特征在于，步骤3)中，轰击条件 为：基因枪样品室的真空度为20mM Pa，轰击压力位IlOOpsi，射程为9cm，轰击1次。6. 如权利要求1所述的甘蔗无载体框架转基因方法，其特征在于，步骤3)中，愈伤 组织采用高渗培养基进行培养，所述高渗培养基为含有0. 2mol/L Sorbitol、0. 2mol/L Mannitol、lmg/L 2, 4-D 和 5. 5g/L 琼脂粉的 MS 培养基。7. 如权利要求1所述的甘蔗无载体框架转基因方法，其特征在于，步骤4)中，采用选择 培养基进行抗性筛选，所述选择培养基为含有3mg/L2, 4-D、5mg/L草丁膦、5. 5g/L琼脂粉的 MS培养基，所述选择培养基的pH值为5. 8。8. 如权利要求7所述的甘蔗无载体框架转基因方法，其特征在于，步骤4)中，使用分化 培养基后和生根培养基进行再生培养，所述分化培养基为含有3mg/L 6-BA、5mg/L草丁膦、 5. Og/L琼脂粉的MS培养基，所述分化培养基的pH值为5. 8 ;所述生根培养基为含有3mg/L NAA、5mg/L草丁膦、5. Og/L琼脂粉的MS培养基，所述生根培养基的pH值为5. 8。9. 如权利要求1所述的甘蔗无载体框架转基因方法，其特征在于，步骤4)后，还包括一 PCR检测步骤，PCR检测采用如下引物序列： 上游引物 SEQ ID No. I :5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3' ； 下游引物 SEQ ID No. 2 :5' -AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。10. 如权利要求9所述的甘蔗无载体框架转基因方法，其特征在于， PCR 检测反应体系：模板 DNA 50-100ng，IOXBuffer I. 5 y L，lOmmol/LdNTPO. 35 y L，1 0mmol/L 上游引物 0? 35 y L, lOmmol/L 下游引物 0? 35 y L, 25mmol/L MgC121. 0 y L, Taq 酶 (5U/ y L) 0? 2 y L，加 CldH2O 至 15 y L ; PCR 反应条件：95°C预变性 3min ;95°C 30sec, 60°C 40sec, 72°C 40sec, 35 个循环；72°C 延伸10min，4°C保存。
【专利摘要】本发明提供一种甘蔗无载体框架转基因方法，具体涉及一种甘蔗无载体框架转基因方法，包括以下步骤：1)提取含有Bar基因的质粒；2)制备无载体框架的Bar基因表达盒；3)基因枪转化：将步骤2)获得的Bar基因表达盒制备DNA微弹，用装载有DNA微弹的基因枪轰击甘蔗愈伤组织，对轰击后的愈伤组织进行培养；4)抗性筛选，再生培养。本发明直接将甘蔗愈伤组织作为受体材料，通过基因枪介导Bar基因表达盒来转化甘蔗愈伤组织，培养后进行抗性筛选和再生，获得含有抗除草剂功能的转基因甘蔗，基因转化率高，能够大大降低转基因成本，节省时间。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/87, C12N15/82
【公开号】CN105039389
【申请号】CN201510374031
【发明人】王继华, 曹干, 张木清, 王丽
【申请人】广东省农业科学院作物研究所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月29日