用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测方法及其引物，以及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于非酒精性脂肪肝相关目的基因 多态性检测方法及其引物，以及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的，以弥 漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝以及由其演变 的脂肪性肝炎（NASH)和肝硬化，胰岛素抵抗和遗传易感性与其发病关系密切。随着肥胖和 糖尿病的高发，NAFLD现已成为我国常见的慢性肝病之一，严重危害人民健康。
[0003] 研究表明NAFLD与SNP有密切关系，所述的SNP是为单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性。NAFLD发病通路中，有许多基因影响，然而检测这些基因多态性的方法有许多 种，比如测序分析方法，但是其成本高，通量低，检测周期较长；又如核酸电泳法，其对样本 要求高；还有TaqMan探针法，其对探针设计较复杂，设计周期长。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的在于：提供一种用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检 测方法的引物。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的方案如下：
[0006] 用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测方法的引物，
[0007] 所述的相关目的基因为三类，分别为胰岛素敏感基因，参与氧化活性代谢和细胞 因子通路基因，以及参与肝脏脂肪代谢基因；
[0008] 所述的胰岛素敏感基因包括为PPARG基因、ADIP0Q基因、ADIP0R2基因；
[0009] 所述的参与氧化活性代谢和细胞因子通路基因为FDFT1基因、TNF基因、AGTR1基 因、PNPLA3基因；
[0010] 所述的参与肝脏脂肪代谢基因为PEMT基因、MTTP基因；
[0011] 所述的PPARG基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0 :1
[0012] 所述的ADIP0Q基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO: 2
[0013] 所述的ADIP0R2基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO: 3
[0014] 所述的FDFT1基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:4
[0015] 所述的TNF基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO: 5
[0016] 所述的AGTR1基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:6
[0017] 所述的PNPLA3基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:7
[0018] 所述的PEMT基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:8
[0019] 所述的MTTP基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:9。
[0020] 扩增引物核苷酸序列表如下
[0021]
[0023] 延伸引物核苷酸序列表如下
[0024]
[0026] 相对于现有技术，本发明的基因引物具有相应的特异性，长度合适，转录高效，不 会形成二级结构，引物自身少于连续4个碱基的互补，引物之间少于连续4个碱基的互补， 引物端可以修饰。
[0027] 本发明的第二个目的在于，提供一种用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检 测方法，包括以下步骤，
[0028] S1、选取相关目的基因样本，配置样本基因的浓度为5~10ng/iil ;
[0029] S2、PCR扩增；以相关的基因样本DNA为模板进行扩增，得到含有所述相关目的基 因的PCR产物；
[0030] 所述PCR扩增采用的核苷酸序列为PPARG F/R基因的引物；ADIPOQ F/R基因的引 物，ADIP0R2 F/R基因的引物，FDFT1 F/R基因的引物；TNF F/R基因的引物；AGTR1 F/R基 因的引物；PNPLA3 F/R基因的引物；PEMT F/R基因的引物；MTTP F/R基因的引物；
[0031] S3、PCR产物的纯化；每10 y 1PCR产物中加入1U磷酸酶SAP酶和1U外切酶I型， 在37°C温浴50~70min，然后75°C下灭活性15min ;
[0032] S4、单碱基延伸反应；在延伸反应体系中加入5 y 1 SNaPshot Multiplex Kit (ABI)，2 y 1纯化的PCR产物，1 y 1延伸引物混合物，2 y 1超纯水，然后进行延伸热循环 程序，得到延伸产物；
[0033] S5、延伸产物纯化，每10 y 1延伸产物中加入1U磷酸酶SAP酶，在37°C温浴50~ 70min，然后75°C下灭活性15min ;
[0034] S6、将延伸产物用ABI3500测序仪测序，取0. 5 y 1纯化后的延伸产物，加入 0. 5 y lLizl20 size standard内标和Hi-Di甲酰胺混匀，在95°C变性5分钟后，放置冰面 5min，再用ABI3500测序仪，在ABI3500测序仪上用3500 Series Software 2软件记录原 始数据，用GeneMapper 5. 0软件分析。
[0035] 作为本发明所述的用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测方法的一种 改进，S2步骤中PCR扩增步骤具体为在扩增PCR反应体系加入lx GC-I缓冲剂，3. OmM Mg2+, 0? 3mM dNTP, 1U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 y 1 样本 DNA 和 1 y 1 PCR 引物，经过第一步95°C处理2min ;第二步按照94°C、20s，65°C、40s，72°C、1. 5min进行11个 循环处理，第三步按照94°C、20s，59°C、30s，72°C、1. 5min进行24个循环处理，第四步72°C 处理2min，最后4°C处理。
[0036] 作为本发明所述的用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测方法的一种改 进，所述1 y 1 PCR引物其中每条引物的浓度为luM。
[0037] 作为本发明所述的用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测方法的一种 改进，S4步骤中延伸热循环程序的条件为在96°C处理lmin，然后：按照96°C、10s，52°C、 58,60°(：、3〇8，进行28个循环，最后 ：4°(：处理。
[0038] 所述的S4步骤中PPARG基因的引物浓度为0. 4uM，其余各引物的浓度均为0. 8uM。
[0039] 现对于现有技术本发明具有以下优点，第一，引物在PRC过程合成周期短，一周之 内可以合成完毕；第二，可以做多重的SNP检测，降低了检测成本；第三，样本数量范围较 宽，100到1000的样本量都很适合；第四，检测位点成功率和准确率>95%。
[0040] 本发明的第三个目的在于，提供一种用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检 测的试剂盒包括以下试剂：
[0041] (l)PCR扩增试剂，包括PCR引物、DNA聚合酶、dNTPs、PCR反应缓冲液；所述PCR扩 增引物是序列为
[0042] 扩增引物核苷酸序列表如下
[0043]
[0045] (2) PCR产物纯化试剂，包括SAP和核酸外切酶I ;
[0046] (3)单碱基延伸反应试剂，包括：延伸引物、单碱基延伸酶、ddNTPs、延伸反应缓冲 液；所述单碱基延伸酶是TaqDNA聚合酶；延伸引物核苷酸序列表如下
[0047]
[0048] 所示引物中的一条或多条，所述ddNTPs进行荧光标记。
[0049] 相对于现有技术，本发明的试剂盒多个引物可同时存在于混合液中，而不影响结 果准确性；可以同时检测非酒精性脂肪肝多个基因多态性，节约成本及时间。
【具体实施方式】
[0050] 下面将结合【具体实施方式】和核苷酸序列表对本发明及其有益效果作进一步详细 说明，但是，本发明的【具体实施方式】并不局限于此。用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态 性检测方法的引物，
[0051] 所述的相关目的基因为三类，分别为胰岛素敏感基因，参与氧化活性代谢和细胞 因子通路基因，以及参与肝脏脂肪代谢基因；所述的胰岛素敏感基因包括为PPARG基因、 ADIP0Q基因、ADIP0R2基因；所述的参与氧化活性代谢和细胞因子通路基因为FDFT1基因、 TNF基因、AGTR1基因、PNPLA3基因；
[0052] 所述的参与肝脏脂肪代谢基因为PEMT基因、MTTP基因；
[0053] 所述的PPARG基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO :1
[0054] 所述的ADIP0Q基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO: 2
[0055] 所述的ADIP0R2基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO: 3
[0056] 所述的FDFT1基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:4
[0057] 所述的TNF基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO: 5
[0058] 所述的AGTR1基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:6
[0059] 所述的PNPLA3基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:7
[0060] 所述的PEMT基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:8
[0061] 所述的MTTP基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:9。
[0062] 扩增引物核苷酸序列表如下
[0063]
[0064] 延伸引物核苷酸序列表如下
[0065]
[0067] 本发明收集了 194例研究案例，其中B超确认NAFLD92例，正常102例。对所有样 本进行SNP分型，其位点为，TNF基因rs361525位点、PPARG基因rsl0865710位点、ADIP0Q 基因 rsl501299 位点、FDFT1 基因 rs2645424 位点、AGTR1 基因 rs3772622 位点、MITP 基因 rs3816873 位点、PNPLA3基因 rs738409 位点、ADIP0R2 基因 rs767870 位点、PEMT基因 rs7946 位点。
[0068] 其核苷酸序列表
[0069]
[0070]
[0071]
[0072] 本发明的基因引物具有相应的特异性，长度合适，转录高效，不会形成二级结构， 引物自身少于连续4个碱基的互补，引物之间少于连续4个碱基的互补，引物端可以修饰。
[0073] 本发明一种用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测方法，包括以下步骤，
[0074] S1、选取相关目的基因样本，配置样本基因的浓度为5~10ng/iil ;
[0075] S2、PCR扩增；以相关的基因样本DNA为模板进行扩增，得到含有所述相关目的基 因的PCR产物，所述1 y 1 PCR引物其中每条引物的浓度为luM ;
[0076] 所述PCR扩增采用的核苷酸序列为PPARG F/R基因的引物；ADIPOQ F/R基因的引 物，ADIP0R2 F/R基因的引物，FDFT1 F/R基因的引物；TNF F/R基因的引物；AGTR1 F/R基 因的引物；PNPLA3 F/R基因的引物；PEMT F/R基因的引物；MTTP F/R基因的引物；
[0077] S2步骤中PCR扩增步骤具体为在扩增PCR反应体系加入lx GC-I缓冲剂，3. OmM Mg2+, 0? 3mM dNTP, 1U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 y 1 样本 DNA 和 1 y 1 PCR 引物，经过第一步95°C处理2min ;第二步按照94°C、20s，65°C、4