0s，72°C、1. 5min进行11个 循环处理，第三步按照94°C、20s，59°C、30s，72°C、1. 5min进行24个循环处理，第四步72°C 处理2min，最后4°C处理。
[0078] 扩增PCR反应体系具体配置如下表：
[0079]
[0081] 多重PCR循环程序的设定
[0082]
[0083] 多重引物的处理：
[0084] ?英潍捷基合成干粉引物（10D)
[0085] ?根据干粉引物的nmol数加稀释液稀释成100 y M的母液
[0086] ?用母液加稀释液稀释成1 y M的反应工作液
[0087] 多重PCR引物中各对引物的浓度：（y M)
[0088]
[0090] 上面表格表示各对引物在多重PCR引物工作液中的终浓度（yM)，以稀释100ul 的多重PCR反应工作液为例，在1. 5ml的离心管中加入91ul的稀释液，然后将稀释好的 100 yM的引物母液每条各加lul即可得到100ul的多重PCR引物反应工作液。
[0091] S3、PCR产物的纯化；每10 y 1PCR产物中加入1U虾碱磷酸酶SAP酶和1U外切酶 I型，在37°C温浴50~70min，然后75°C下灭活性15min ;
[0092] PCR产物纯化配置如下表
[0093]
[0094] S4、单碱基延伸反应；在延伸反应体系中加入5 u 1 SNaPshot Multiplex Kit (ABI)，2 y 1纯化的PCR产物，1 y 1延伸引物混合物，2 y 1超纯水，然后进行延伸热循环 程序，得到延伸产物；
[0095] 单碱基延伸反应配置如下表
[0096]
[0097] 注：SNaPshot Multiplex Kit为ABI公司专为SNP开发的测序组合套装步骤中 PPARG基因的引物浓度为0. 4uM，其余各引物的浓度均为0. 8uM。
[0098] 延伸引物混合物中各条延伸引物的浓度如下表：（yM)
[0099]
[0100] 上面表格表示每个位点延伸引物在多重工作液中的终浓度（yM)，以稀释100ul 的多重延伸引物工作液为例，在1. 5ml的离心管中加入93. 2ul的稀释液，然后将稀释好的 100yM的延伸引物母液每条各加0.8ul(rsl0865710SR引物加0.4ul)即可得到100ul的多 重延伸引物反应工作液。
[0101] 步骤中延伸热循环程序的条件为在96°c处理lmin，然后：按照96°C、10s，52°C、 58,60°(：、3〇8，进行28个循环，最后 ：4°(：处理。
[0102] 延伸反应程序见下表
[0103]
[0104] S5、延伸产物纯化，每10 y 1延伸产物中加入1U磷酸酶SAP酶，在37°C温浴50~ 70min，然后75°C下灭活性15min ;
[0105] S6、将延伸产物用ABI3500测序仪测序，取0. 5yl纯化后的延伸产物，加入 0. 5 y lLizl20 size standard内标和Hi-Di甲酰胺混匀，在95°C变性5分钟后，放置冰面 5min，再用ABI3500测序仪，在ABI3500测序仪上用3500 Series Software 2软件记录原 始数据，用GeneMapper 5. 0软件分析。
[0106] 本发明具有以下优点，第一，引物在PRC过程合成周期短，一周之内可以合成完 毕；第二，可以做多重的SNP检测，降低了检测成本；第三，样本数量范围较宽，100到1000 的样本量都很适合；第四，检测位点成功率和准确率>95%。
[0107] 本发明一种用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测的试剂盒包括以下试 剂：
[0108] (l)PCR扩增试剂，包括PCR引物、DNA聚合酶、dNTPs、PCR反应缓冲液；所述PCR扩 增引物是序列为
[0109] 扩增引物核苷酸序列表如下
[0110]
[0112] (2) PCR产物纯化试剂，包括SAP和核酸外切酶I;
[0113] (3)单碱基延伸反应试剂，包括：延伸引物、单碱基延伸酶、ddNTPs、延伸反应缓冲 液；所述单碱基延伸酶是TaqDNA聚合酶；延伸引物核苷酸序列表如下
[0114]
[0116] 所示引物中的一条或多条，所述ddNTPs进行荧光标记。
[0117] 本发明的试剂盒多个引物可同时存在于混合液中，而不影响结果准确性；可以同 时检测非酒精性脂肪肝多个基因多态性，节约成本及时间。
【主权项】
1. 用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测方法的引物，其特征在于： 所述的相关目的基因为三类，分别为胰岛素敏感基因，参与氧化活性代谢和细胞因子 通路基因，以及参与肝脏脂肪代谢基因； 所述的胰岛素敏感基因包括为PPARG基因、ADIPOQ基因、ADIP0R2基因； 所述的参与氧化活性代谢和细胞因子通路基因为FDFTl基因、TNF基因、AGTRl基因、 PNPLA3 基因； 所述的参与肝脏脂肪代谢基因为PEMT基因、MTTP基因； 所述的PPARG基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO: 1 所述的ADIPOQ基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:2 所述的ADIP0R2基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:3 所述的FDFTl基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:4 所述的TNF基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO: 5 所述的AGTRl基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:6 所述的PNPLA3基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:7 所述的PEMT基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:8 所述的MTTP基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:9。2. 用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测方法，其特征在于：包括以下步骤， S1、选取相关目的基因样本，配置样本基因的浓度为5~lOng/yl ;S2、PCR扩增；以相 关的基因样本DNA为模板进行扩增，得到含有所述相关目的基因的PCR产物； 所述PCR扩增采用的核苷酸序列为PPARG F/R基因的引物； ADIPOQ F/R基因的引物，ADIP0R2F/R基因的引物，FDFT1F/R基因的引物；TNF F/R基 因的引物；AGTR1F/R基因的引物； PNPLA3F/R基因的引物；PEMT F/R基因的引物；MTTP F/R基因的引物； 53、 PCR产物的纯化；每10 y I PCR产物中加入IU虾碱磷酸酶SAP酶和IU外切酶I型， 在37°C温浴50~70min，然后75°C下灭活性15min ; 54、 单碱基延伸反应；在延伸反应体系中加入5yl SNaPshot Multiplex Kit (ABI)，2 y 1纯化的PCR产物，I y 1延伸引物混合物，2 y 1超纯水，然后进行延伸热循环 程序，得到延伸产物； 55、 延伸产物纯化，每10 y 1延伸产物中加入IU磷酸酶SAP酶，在37 °C温浴50~ 70min，然后75°C下灭活性15min ; 56、 将延伸产物用ABI3500测序仪测序，取0. 5 y 1纯化后的延伸产物，加入 0. 5 y ILiz 120size standard内标和Hi-Di甲酰胺混匀，在95°C变性5分钟后，放置冰面 5min，再用ABI3500测序仪，在ABI3500测序仪上用3500Series Software 2软件记录原始 数据，用GeneMapper5. 0软件分析。3. 根据权利要求2所述的用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测方法，其特 征在于：S2步骤中PCR扩增步骤具体为在扩增PCR反应体系加入lx GC-I缓冲剂，3. OmM Mg2+，0? 3mM dNTP, IU HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc. )，I y 1 样本 DNA 和 I y I PCR 引物，经过第一步95°C处理2min ;第二步按照94°C、20s，65°C、40s，72°C、I. 5min进行11个 循环处理，第三步按照94°C、20s，59°C、30s，72°C、I. 5min进行24个循环处理，第四步72°C 处理2min，最后4°C处理。4. 根据权利要求3所述的用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测方法，其特征 在于：所述I y I PCR引物其中每条引物的浓度为luM。5. 根据权利要求2所述的用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测方法，其特 征在于：S4步骤中延伸热循环程序的条件为在96°C处理lmin，然后：按照96°C、10s，52°C、 58,60°(：、3〇8，进行28个循环，最后 ：4°(：处理。6. 根据权利要求2所述的用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测方法，其特征 在于：所述的S4步骤中PPARG基因的引物浓度为0. 4uM，其余各引物的浓度均为0. 8uM。7. 用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测的试剂盒，其特征在于，包括以下试 剂： (1) PCR扩增试剂，包括PCR引物、DNA聚合酶、dNTPs、PCR反应缓冲液；所述PCR引物是 序列为 所述的PPARG基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO: 1 所述的ADIPOQ基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:2 所述的ADIP0R2基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:3 所述的FDFTl基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:4 所述的TNF基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO: 5 所述的AGTRl基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:6 所述的PNPLA3基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:7 所述的PEMT基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:8 所述的MTTP基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:9; (2) PCR产物纯化试剂，包括SAP和核酸外切酶I ; (3) 单碱基延伸反应试剂，包括：延伸引物、单碱基延伸酶、ddNTPs、延伸反应缓冲液； 所述单碱基延伸酶是TaqDNA聚合酶；所述延伸引物为序列如所述的PPARG基因的引物其核 苷酸序列SEQ ID NO :1 所述的ADIPOQ基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:2 所述的ADIP0R2基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:3 所述的FDFTl基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:4 所述的TNF基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO: 5 所述的AGTRl基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:6 所述的PNPLA3基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:7 所述的PEMT基因的引物其核苷酸序列SEQ ID N0:8 所述的MTTP基因的引物其核苷酸序列SEQ ID NO:9; 所示引物中的一条或多条，所述ddNTPs进行荧光标记。
【专利摘要】本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于非酒精性脂肪肝相关目的基因多态性检测方法及其引物，以及试剂盒，本发明针对非酒精性脂肪肝相关目的基因提供检测方法和引物，本发明的基因引物具有相应的特异性，长度合适，转录高效，不会形成二级结构，引物自身少于连续4个碱基的互补，引物之间少于连续4个碱基的互补，引物端可以修饰，本发明检测方法具有以下特点第一，引物在PRC过程合成周期短，一周之内可以合成完毕；第二，可以做多重的SNP检测，降低了检测成本；第三，样本数量范围较宽，100到1000的样本量都很适合；第四，检测位点成功率和准确率>95％。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105039513
【申请号】CN201510287499
【发明人】周永健, 聂玉强, 李瑜元, 王红, 杜艳蕾, 陈慧婷, 李玉碧
【申请人】广州市第一人民医院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年5月29日