一种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动植物染色体遗传与生物技术领域，涉及一种利用寡聚核苷酸探针染 液涂染染色体的新方法。
【背景技术】
[0002] 染色体分带技术是二十世纪六十年代末建立起来的，现已成为追踪特定染色体 (质），识别染色体结构一种重要工具。Gill等（1991)(见参考文献：Gill B S，Friebe B，Endo T R. Standard karyotype and nomenclature system for description of chromosome bands and structural aberration in wheat.Genome，1991，34 :830_834) 建立了基于小麦c-分带的标准带型，并广泛应用于鉴定外源染色体变异系（见参考文 南犬：Jiang J，Gill BS. Sequential chromosome banding and in situ hybridization analysis. Genome，1993,36 :792-795)。随着原位杂交技术的发展，人们发现物种专化 性重复序列的质粒探针在植物染色体上产生清晰稳定的特征信号，比染色体分带更容易 用于染色体识别和区分。Mukai等（1993)(见参考文献：Mukai Y B，Akahara Yumikon， Yamamoto Maki. Simultaneous discrimination of the three genomes in hexaploid wheat by multicolor fluorescence in situ hybridization using total genomic and highly repeated DNA probes. Genome，36 :489_494)以重复序列 pAsl 和 pScll9. 2 为探 针的多色原位杂交识别了小麦21对中的17对染色体。基于GAA微卫星和pAsl成功的分 辨了小麦所有染色体（见参考文献：Pedersen C，Langridge P. Identification of the entire chromosome complement of bread wheat by two-color FISH. Genome，1997， 40 :589-593)。更有趣的是 Cuadrado 等（2009)(见参考文献：CuadradoA, Golczyk H， Jouve N.A novel, simple and rapid nondenaturing FISH(ND-FISH)technique for the detection of plant telomeres， potential used and possible target structures detected. Chromosome Res，2009,17:755-762)发现无需事先进行染色体变性，植物染色 体端粒序列即可在染色体上产生信号，建立了非变性荧光原位杂交技术（ND-FISH)。在此 基础上 Cuadrado 等（2〇10)(见参考文献：Cuadrado 人，Jouve N. Chromosomal detection of simple sequence repeats(SSRs)using nondenaturing FISH(ND-FISH) ? Chromosoma， 2010,119 :495-503)又以SSR为探针，进行ND-FISH，发现多数序列均可产生几乎与变性 FISH相同的杂交效果。
[0003] 寡聚核苷酸寡探针，是一种人工合成的、根据探针靶序列的碱基顺序用化学方法 合成的单链DNA或RNA。在小麦中，王艳芝（见参考文献：王艳芝.百萨偃麦草染色体小片 段易位的创制、鉴定与基因定位分析.南京农业大学硕士论文，2013)首次把小麦重复序列 质粒探针pScll9. 2和pAsl转化为寡聚核苷酸探针，并发现根据pScll9. 2核心序列开发的 长度为59bp的2个寡核苷酸探针pScll9. 2-1和pScll9. 2-2均产生与pScll9. 2质粒探针 完全重叠的信号，而据pAsl核心序列开发的6个寡核苷酸pAsl-1~6则产生了很多不一致 的杂交信号，其中寡核苷酸探针pScl 19. 2-1和pScl 19. 2-2可以成功用于非变性FISH(见 会议文南犬：Wang Yanzhi ；Liu Zhitao ；Pu Jing ；ffang Qing ；Zhuang Lifang ；Qi Zengjun. Development and application of oligodeoxynucleotide probes derived from highly repetitive sequences pScll9. 2 and pAsl (abstract) ?第四届全国小麦基因组学及分 子育种大会（Wheat genomics and molecular breeding in China IV). 2013. Nanjing. P. 94)，为开发小麦乃至其他植物寡核苷酸探针提供了重要信息。Tang等（2014)(见参考文 南犬：Zongxiang Tang, Zujun Yang, Shulan Fu. Oligonucleotides replacing the roles of repetitive sequences pAsl，pScll9. 2,pTa-535,pTa71，CCS1，and pAWRC. 1 for FISH analysis. J Appl Genetics，2014，DOI 10. 1007)报道了 9个基于小麦和黑麦着丝粒等重 复序列开发的寡聚核苷酸探针，其中包括2个来自pScll9. 2和pAsl的寡核苷酸探针，表 明这些寡核苷酸探针可以代替原来的质粒序列并成功用于小麦染色体的鉴定。随后，可 以替代基因组原位杂交的黑麦基因组专化寡居核苷酸探针也被开发出来，实现了基因组 ND-FISH(见参考文南犬：Shulan Fu，Lei Chen, Yangyang Wang, Meng Li, Zujun Yang, Ling Qiu，Benju Yan，Zhenglong Ren，Zongxiang Tang. Oligonucleotide Probes for NDFISH Analysis to Identify Rye and Wheat Chromosomes. Scientific Reports，2015，DOI : 10. 1038)。Han等（2015)以黄瓜为例，发展了一种针对单条染色体涂染的寡居核苷酸探针 开发方法（见参考文南犬：Yonghua Han，Tao Zhang，Paradee Thammapichai, Yiqun ffeng, and Jiming Jiang. Chromosome-specific painting in Cucumis species using bulked oligonucleotides. Genetics，2015, DOI : 10. 1534)。寡聚核苷酸探针开发及 ND-FISH 的发 展将大大提高原位杂交效率，具有重要的应用潜力。
[0004] 本专利在寡居核苷酸探针开发及ND-FISH研究的基础上，通过连续6年的研究发 现，通过优化寡居核苷酸序列长度可以有效地提高ND-FISH的效率，大大节省原位杂交成 本，并为开发基于寡核苷酸探针的新型染色体涂染染液提供了可能，本专利以普通小麦中 国春和栽培黑麦荆州黑麦为例，公开了一种开发寡聚核苷酸探针染液并进行染色体涂染的 新方法，为简化原位杂交程序，实现原位杂交自动化，开发商业化检测试剂盒及商业化检测 提供了新的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于公开一种开发寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新型染色体 分带方法。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0007] 1. -种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法，其所用的寡核苷酸序列特 征如下所示：其中 FAM-5' GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA3'，FAM-5' GAAGAAGAAGAAG AAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA3，和 FAM-5，AACAACA AACAACAAC3'为本专利合成，其余探针序列来自王艳芝（2013)(见参考文献：王艳芝.百萨 偃麦草染色体小片段易位的创制、鉴定与基因定位分析.南京农业大学硕士论文，2013)。
[0008]
[0009] 2. -种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法，其特征在于：包括如下步 骤：
[0010] (1)以发展普通小麦中国春寡聚核苷酸探针染液涂染中国春染色体为例，利用 SSR重复序列GAA、质粒DNA pScll9. 2和pAsl核心序列人工合成寡聚核苷酸探针（GAA) 5、(GAA) 10、（GAA)19、pScll9. 2-1、pAsl-1、pAsl-2、pAsl-3、pAsl-4、pAsl-5和pAsl-6 ; [0011] (2)利用非变性荧光原位杂交对步骤（1)中不同长度寡聚核苷酸探针（GAA)5、 (GAA) 10、（GAA) 19进行信号强度比较，选择能够低浓度高效侵染染色体的寡居核苷酸，获得(GAA) 10,同样获得探针pScll9. 2-1、pAsl-1、pAsl-3、pAsl-4、pAsl-5和pAsl-6 ;
[0012](3)根据各探针原位杂交信号强度选择各探针最优浓度，（GAA) 10 (0.0 lng/ y 1)、 pScl 19. 2-1 (0? 2ng/ y 1)、pAsl-1 (0? 3ng/ y 1)、pAsl-3 (5ng/ y 1)、pAsl-4 (10ng/ y 1)、 pAsl_5(0. 3ng/ii 1)和 pAsl_6(5ng/ii 1);
[0013] (4)按照步骤⑶中探针浓度配比，对不同探针进行混合加在灭菌的 2XSSC(0.015M C6H5Na307.2H20-0. 15M NaCl)中，配成探针染液。
[0014] (5)将准备好的根尖中期染色体制片置于步骤（4)探针染液中，37°C杂交染色 6h后，取出载玻片，用蒸馏水冲洗3次，滴加6yl VECTASHIELD Mounting Medium for Fluorescence with DAPI (Vector)，盖上盖玻片，在焚光显微镜下观察照相。
[0015] 本发明提供的方法，概括性地表述如下：
[0016] 利用物种专化重复序列或基因组序列设计的寡居核苷酸探针，通过比较不同长度 探针非变性原位杂交信号强度，选择合适长度探针，并优化确定探针浓度。按照探针浓度 进行配比加入到2XSSC中混合成探针染液，取组配好的探针染液直接盛放于玻璃染色缸 (高7. 6cm，内径3cm)中，将准备好的染色体制片直接置于染液中，37°C染色6h，拿出载玻 片，用蒸馈水冲洗3次，滴加6 yl VECTASHIELD Mounting Medium for Fluorescence with D