API (Vector)，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察照相。
[0017] 与传统原位杂交程序相比较，本发明方法省去了染色液直接滴加在每张制片上的 过程，而且染液可以重复利用，并能同时进行批量制片染色，具有简单、快捷、节约成本的特 点；本发明通过优化寡核苷酸探针长度和浓度配比，组配成功的可用于小麦和黑麦染色体 分析的三个探针染液说明本方法可以用于多种生物的染色体分析，开发系列的商业化的寡 核苷酸染液，为染色体分析自动化和商业化检测提供了可能。
[0018] 有益效果：
[0019] 1.本发明以普通小麦中国春和栽培黑麦荆州黑麦为例，公开了一种利用寡聚核苷 酸探针染液涂染染色体的新型染色体分带方法，染色方法简单快捷，节省成本，可以同时对 批量染色体制片进行处理，染液可重复利用，获得的染色体带型清晰稳定。
[0020] 2.本发明为染色体原位杂交自动化分析和商业化检测提供了可能。
[0021] 3.本发明公布了 9个染色体寡核苷酸探针，并发展了三种探针染液，说明本发明 提供的方法的可行，该染液在中国春及黑麦染色体上产生了丰富带型。
[0022] 4.本发明说明利用不同浓度和配比混合的寡核苷酸探针可以开发染色体涂染试 剂盒，具有重要的商业价值。
【附图说明】
[0023] 图 1 探针终浓度为 33. 33ng/ y 1 (GAA) 5、（GAA) 10 和（GAA) 19 长度 ND-FISH 比较 结果。a-b 图：（GAA) 5DAPI 染色和 ND-FISH ;c-d 图：（GAA) 10DAPI 染色和 ND-FISH ;e-f 图： (GAA)19DAPI染色和ND-FISH。可以看出（GAA)5信号很弱，（GAA)10和（GAA)19信号明显 好于（GAA) 5。
[0024] 图2探针终浓度为333. 3ng/ y 1 (GAA) 5和探针终浓度为0? Olng/ y 1 (GAA) 10长 度 ND-FISH 比较结果。a-b 图：（GAA) 5DAPI 染色和 ND-FISH ;c-d 图：(GAA) 10DAPI 染色和 ND-FISH。可以看出（GAA) 5终浓度达到333. 3ng/ y 1和终浓度为仅为0.0 lng/ y 1 (GAA) 10 均可产生清晰的杂交信号，但浓度却相差33333倍。
[0025] 图 3 pAsl-1、pAsl-2、pAsl-3、pAsl-4、pAsl-5 和 pAsl-6 探针 ND-FISH 及利用 质粒pAsl定位结果。a图：pAsl-1 (红）和质粒pAsl (绿）FISH ;b图：pAsl_2(红）和 质粒 pAsl (绿）FISH;c 图：pAsl-3(红）和质粒 pAsl (绿）FISH;d 图：pAsl-4(红）和质 粒 pAsl (绿）FISH;e 图：pAsl-5(红）和质粒 pAsl (绿）FISH;f 图：pAsl-6(红）和质粒 pAsl (绿）FISH。可以看出pAsl-1和pAsl-5产生与质粒pAsl相似的杂交信号，pAsl-2、 pAsl-3、pAsl-4和pAsl-6产生了与质粒pAsl不同的杂交信号。
[0026] 图4 "染液1"对中国春染色体染色结果，绿色为pScll9. 2-1，红色为pAsl-1和 pAsl-5。可以看出中国春染色体上产生了清晰稳定的杂交信号。
[0027] 图5"染液2"对中国春染色体染色结果，绿色为（GAA) 10,红色为pAsl-1和pAsl-5。 可以看出中国春染色体上产生了清晰稳定的杂交信号。
[0028] 图6同一染缸"染液3"对不同批次黑麦染色体染色结果，绿色为pScll9. 2-1，红色 为（AAC) 10。a图：第1批次染色结果图片；b图：第5批次染色结果图片。由图可以看出， 与第1批次相比，第5批次染色结果同样产生了清晰稳定的杂交信号，说明染液可重复多次 利用。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段。
[0030] 实施例1
[0031] 以发展普通小麦中国春寡聚核苷酸探针染液涂染中国春染色体为例
[0032] 利用SSR重复序列GAA、质粒DNA pScll9. 2和pAsl核心序列人工合成寡聚核苷酸 探针（GAA)5、（GAA)10、（6厶厶)19、？5。119.2-1、？厶81-1、？厶81-2、？厶81-3、？厶81-4、卩厶81-5和 pAsl-6;利用非变性荧光原位杂交对不同长度寡聚核苷酸探针（GAA) 5、（GAA) 10、（GAA) 19 进行信号强度比较，选择能够低浓度高效侵染染色体的寡居核苷酸，获得（GAA)10(见 图 1)，同样获得探针 pScll9. 2-1、pAsl-1、pAsl-3、pAsl-4、pAsl-5 和 pAsl-6 ;根据各探 针原位杂交信号强度选择各探针最优浓度，（GAA) 10 (0.0 lng/ y 1)、pScll9. 2-1 (0. 2ng/ y 1)、pAsl-1 (0? 3ng/ y 1)、pAsl-3 (5ng/ y 1)、pAsl-4 (10ng/ y 1)、pAsl-5 (0? 3ng/ y 1)和 pAsl-6(5ng/iil)(见图2和图3);根据探针浓度配比，对不同探针进行混合加在灭菌的 2XSSC(0. 015M C6H5Na307. 2H20-0. 15M NaCl)中，配成探针染液，最终混合了两种探针 染液分别为"染液 1"（〇? 2ng/ y 1 pScll9. 2-l，0. 3ng/ y 1 pAsl-1 和 0? 3ng/ y 1 pAsl-5， 见图 4)和"染液 2"（0.01ng/yl(GAA)10,0.3ng/yl pAsl-1 和 0.3ng/yl pAsl-5,见图 5)。分别取组配好的染液30ml盛放于玻璃染色缸中，将准备好的根尖中期染色体制片置 于探针染液中，于37°C培养相中染色6h-7h后，取出载玻片，用蒸馏水冲洗3次，滴加6 y 1 VECTASHIELD Mounting Medium for Fluorescence with DAPI (Vector)，盖上盖玻片，在焚 光显微镜下观察照相。
[0033] 实施例2
[0034] 以发展黑麦寡聚核苷酸探针染液涂染荆州黑麦染色体为例
[0035] 利用SSR重复序列AAC和质粒DNApScll9. 2核心序列人工合成寡聚核苷酸探针 (AAC) 10和pScll9. 2-1 ;利用非变性荧光原位杂交对不同长度寡聚核苷酸探针进行信号 强度比较，并根据各探针原位杂交信号强度选择各探针最优浓度（AAC)10(0.02ng/yl)、 pScl 19. 2-1 (0? 2ng/ y 1)、pAsl-1 (0? 3ng/ y 1)、pAsl-3 (5ng/ y 1)、pAsl-4 (10ng/ y 1)、 pAsl-5(0. 3ng/iil)和pAsl-6(5ng/iil);根据探针浓度配比，对不同探针进行混合加在 灭菌的 2XSSC(0.015M C6H5Na307.2H20-0.15M NaCl)中，配成探针"染液 3"（0.01ng/ y 1 (AAC) 10和0. 2ng/ y 1 pScll9. 2-1)。将准备好的根尖中期染色体制片置于探针染液 中，37°C杂交染色6h后，取出载玻片，用蒸馏水冲洗3次，滴加6yl VECTASHIELD Mounting Medium for Fluorescence with DAPI (Vector)，盖上盖玻片，在焚光显微镜下观察照相。用 同一染缸"染液3"顺序进行5次试验，以检测染液的可重复利用性（见图6)。
[0036] 表1中国春及黑麦寡居核苷酸探针标记
[0037]
[0038] 可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发 明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这 些改进和变更也属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法，开发染液的寡核苷酸探针序列 特征如下：2. -种利用寡聚核苷酸探针染液涂染染色体的新方法，其特征在于：包括如下步骤： (1)以发展普通小麦中国春寡聚核苷酸探针染液涂染中国春染色体为例，利用SSR 重复序列GAA、质粒DNA pScll9. 2和pAsl核心序列人工合成寡聚核苷酸探针（GAA)5、 (GAA)10、（GAA)19、pScll9. 2-1、pAsl-1、pAsl-2、pAsl-3、pAsl-4、pAsl-5和pAsl-6 ; (2) 利用非变性荧光原位杂交对步骤（I)中不同长度的寡聚核苷酸探针（GAA)5、 (GAA) 10、（GAA) 19进行信号强度比较，选择能够在低浓度下高效侵染染色体的寡居核苷酸， 发现（GAA) 10,同样获得探针pScll9. 2-1、pAsl-1、pAsl-3、pAsl-4、pAsl-5和pAsl-6 ; (3) 根据各探针原位杂交信号强度选择各探针最优浓度，（GAA)10(0.01ng/yl)、 pScll9. 2-1 (0? 2ng/yI)、pAsl-1 (0? 3ng/yI)、pAsl-3 (lOng/yI)、pAsl-4 (lOng/y1)、 pAsl_5(0. 3ng/iiI)和pAsl_6(10ng/iiI); (4) 按照步骤（3)中探针浓度配比，对不同探针进行混合加在灭菌的2XSSC(0.015M C6H5Na3O 7.跗2〇-〇.I5MNaCl)中。 (5) 将准备好的根尖中期染色体制片置于步骤（4)中探针染液中，37°C杂交6h后，取出 载玻片，用蒸馈水冲洗 3 次，滴加 6yIVECTASHIELDMountingMediumforFluorescence withDAPI(Vector)，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察照相。3. 权利要求2所述的利用寡聚核苷酸探针在发展人类、动物和植物染色体寡聚核苷酸 探针染液上的应用。4. 权利要求2所述利用本发明方法利用寡聚核苷酸探针染液在商业化试剂盒开发及 商业化检测中的应用。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，提供了一种开发寡核苷酸探针染液涂染染色体的新方法。以普通小麦中国春和栽培黑麦荆州黑麦为例，利用基于重复序列开发的寡核苷酸探针，通过比较非变性原位杂交信号，确定最佳探针长度和浓度，按照信号强度进行不同探针配比并溶解到2×SSC中形成探针染液，将染色体制片在染液中直接进行染色，获得清晰稳定的中国春和荆州黑麦寡核苷酸涂染核型。方法具有简单快捷、一次可处理多张染色体制片、染液可重复利用的特点，利于提高原位杂交的自动化和商业化水平。同时公布了10个寡核苷酸探针序列和三种鸡尾酒探针染液，为小麦和黑麦染色体工程提供了新的方法，也为其他物种寡核苷酸染液的开发提供了范例。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105039542
【申请号】CN201510428499
【发明人】亓增军, 杜培
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月17日