一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物技术领域，尤其是一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法，该方 法基于荧光定量PCR、能快速准确测定植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆 菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌六种乳杆菌在肠道的定植能力。
【背景技术】
[0002]乳酸菌是一群能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的总称，乳酸菌中比 较重要的属有：乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、链球菌属、片球菌属、明串珠菌属等，其中， 乳杆菌属细菌因其良好的生长发酵特性及益生功能，被广泛应用于食品发酵、工业乳酸生 产及医疗保健等领域，与人类每日生活密切相关。乳杆菌具备了良好的发酵特性及益生功 效，不仅能够提尚食品的营养价值，改善食品风味，提尚其附加值及保减性，而且能够调节 肠道菌群、保持微生态平衡、增强机体免疫作用，但乳酸菌在人体内发挥益生功效的前提条 件是能够通过上消化道顺利到达肠道，牢固地粘附在肠壁上，不会随着食物的运动和肠道 蠕动被逐步排出体外，且能够适应肠道环境，不断繁殖，使自身保持一定数量，即定植于肠 道，因此乳杆菌在肠道定植对其益生功效的形成至关重要，乳杆菌的肠道定植能力在很大 程度上决定了其益生功效的高低，所以，乳杆菌菌株肠道定植能力的评价对于工业应用菌 株整体功能性的评价及筛选具有重要的意义。
[0003] 对于菌株肠道定植能力的测定，目前有以下几种方法：
[0004] 1、传统的平板培养方法
[0005]该方法是通过对摄入菌株后的动物或人粪便中菌株进行选择性平板培养计数，计 算其中菌量。该方法操作繁琐、耗时较长且对选择性培养基的选择精确度有较大的依赖，只 能计算活菌数，不能准确反应菌株在肠道的定植状况。
[0006] 2、梯度变性凝胶电泳（DGGE-PCR)技术
[0007] 该方法对摄入益生菌后的实验动物或人体粪便进行如下处理：总基因组的提取 -16S rRNA可变区扩增一梯度变性凝胶电泳一染色成像一切胶回收一转化克隆一测序比 对，分析数据可得到每个粪便样品中菌系组成及显示条带的菌的相对含量。DGGE-PCR侧重 于样品菌群多样性的分析，能够反映粪便菌群构成与多样性，能够准确定性，但其基于灰度 计算的半定量分析方法不能够达到准确定量的目的，且电泳结束后的后期处理繁琐，在测 序比对这一步会产生大量的费用，不是一种准确快捷的定植能力测定方法。
[0008] 3、基于16S rRNA特异性探针的荧光原位杂交技术
[0009]该技术采用基于菌株的特异性探针进行原位杂交，结合流式细胞仪对灌胃菌株后 的实验动物粪便中带荧光菌株相对含量进行测定。该方法在一定程度能够在微观分子水平 上准确反映菌株在肠道的定植情况，但该方法前期准备工作复杂，需要良好的分子操作能 力，且工作效率较低，而该方法最主要的局限在于只能用于动物实验，无法进行人体实验， 无法准确反映菌株在人体肠道定植情况。
[0010] 4、实时荧光定量PCR法
[0011] 该方法是一种在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用过程中荧光信号 的累积实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。荧光定量 PCR方法步骤如下：
[0012] (1)样品基因组DNA提取
[0013] (2)目的菌种特异性引物设计及验证
[0014] (3)目的菌种标准曲线制作
[0015] (4)荧光定量PCR扩增
[0016] (5)利用标准曲线换算ct值为拷贝数，得到单位粪便样品中乳杆菌的量
[0017] 该方法通过应用特异性引物可以仅通过一次荧光定量PCR将模板中的对应种属 的菌株绝对定量，该方法耗时短，操作方便，定量准确，是一种能够良好应用于粪便样品中 菌株定量测定，进而分析比较菌株定植能力的方法。
[0018] 通过对比，本发明专利申请与上述检测方法相比存在本质的不同，在乳杆菌肠道 定植能力的测定方面具有很大的优势。
【发明内容】
[0019] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，克服了传统平板培养法的局限性和 耗时长，DGGE-PCR方法的操作繁琐、工作量大、费用高及荧光标记方法对受试对象的局限性 等缺陷，提供一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法，该方法基于荧光定量PCR，能够在较短 的时间完成粪便样品中植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌 和保加利亚乳杆菌六种乳杆菌的快速准确定量，进而比较其肠道定植能力。
[0020] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0021] -种乳杆菌肠道定植能力的测定方法，包括如下步骤：
[0022] ⑴收集摄入混合菌液/菌粉的受试者在摄入菌前后的新鲜粪便，得粪便样品；
[0023] ⑵定量称取粪便样品，进行粪便中细菌基因组的提取，得粪便细菌基因组；
[0024] ⑶选择植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利 亚乳杆菌这六种乳杆菌的相应的特异性荧光定量PCR引物，并检测其扩増特异性；
[0025] ⑷分别采用上述六种乳杆菌的细菌基因组为模板，采用步骤⑶中六对特异性荧光 定量PCR引物进行普通PCR，对得到的产物进行切胶回收，测定回收产物浓度，计算出拷贝 数，对产物进行梯度稀释，以稀释后的产物为模板进行荧光定量PCR，采用相应的特异性荧 光定量PCR引物进行荧光定量PCR，得到ct值，分别制作六种乳杆菌拷贝数与ct值之间的 标准曲线；
[0026] (5)以步骤⑵中粪便细菌基因组为模板，分别采用步骤⑶中的六对特异性荧光定量 PCR引物进行荧光定量PCR扩增，得到不同样品荧光定量PCR的ct值，带入步骤⑷中计算 出的相应标准曲线方程中计算出拷贝数，通过换算即可得到单位粪便样品中各种乳杆菌的 量；
[0027](6)比较在摄入混合菌液/菌粉前后的受试者粪便中的乳杆菌含量，即得菌株在肠 道的定植能力。
[0028] 而且，所述步骤⑴中混合菌液/菌粉为含有植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆 菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的混合菌液/菌粉；
[0029] 或者，所述步骤⑴的具体步骤如下：分别制备植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆 菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌菌粉，平板计数计算菌粉中 活菌数，制备含有六种乳杆菌的混合菌液/菌粉，保证其中每种菌的浓度相同，混合菌粉 于-20°C保存备用。
[0030] 而且，所述步骤⑶中选择植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞 士乳杆菌、保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的相应的特异性荧光定量PCR引物的具体步骤如 下：
[0031] 通过NCBI检索得到植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳 杆菌、保加利亚乳杆菌的16S rRNA序列，通过比对这些序列，找到一种乳杆菌与其他乳杆菌 有差异的可变区序列，根据这些序列采用premier 5. 0软件设计特异性引物，使用该引物 能特异性的扩增出该种类的乳杆菌，达到定量检测的目的。
[0032]而且，所述步骤⑴的具体步骤为：
[0033] 以一定量六种不同乳杆菌混合菌粉或菌液喂食受试者，喂食2-4周之后，停止摄 入乳杆菌，收集摄入乳杆菌前及停止摄入乳杆菌后不同阶段的受试者新鲜粪便100_200mg， 于-80°C冰箱中保存、备用。
[0034] 而且，所述步骤⑶中特异性荧光定量PCR引物是分别针对植物乳杆菌、干酪乳杆 菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的特异性PCR 引物，这六对引物能特异性扩增出该种乳杆菌16S rRNA中的特异性片段，这六对引物分别 为 SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4、SEQ5、SEQ6、SEQ7、SEQ8、SEQ9、SEQ10、SEQ11、SEQ12。
[0035] 而且，所述步骤⑶中对六对特异性荧光定量PCR引物的扩增特异性的检测，步骤 如下：
[0036] 第一步：准备六种乳杆菌的纯培养物，进行细菌基因组的提取，细菌基因组提取方 法如下：
[0037] ①取培养过夜后的六种菌液l_2ml至EP管中，10000r/min离心2min，弃上清得菌 体；
[0038] ②加入l_2ml无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
[0039] ③加入200ul SDS裂解液，混匀后在65-80°C恒温保温20-30min ;
[0040] ④加入200-300ul酚-氯仿于菌体裂解液中，颠倒混匀后12000r/min离心 5-lOmin，取上清 200ul ;
[0041] ⑤加入400-500ul冰乙醇于200ul上清液中，-20°C静止30-50min之后，12000r/ min离心5-10min，弃上清；
[0042] ?加入500111 70%冰乙醇重悬沉淀，1200(^/111111离心1-3111111，弃上清，常温干燥；
[0043] ⑦用50-100ul ddH20溶解沉淀，即得乳杆菌基因组，之后于_20°C保存、备用；
[0044] 第二步：以得到的乳杆菌基因组为模板，采用六对特异性荧光定量PCR引物进行 普通