乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳 杆菌这六种乳杆菌的相应的特异性荧光定量PCR引物，并检测其扩増特异性； ⑷分别采用上述六种乳杆菌的细菌基因组为模板，采用步骤⑶中六对特异性荧光定量 PCR引物进行普通PCR，对得到的产物进行切胶回收，测定回收产物浓度，计算出拷贝数，对 产物进行梯度稀释，以稀释后的产物为模板进行荧光定量PCR，采用相应的特异性荧光定量 PCR引物进行荧光定量PCR，得到ct值，分别制作六种乳杆菌拷贝数与ct值之间的标准曲 线； (5) 以步骤⑵中粪便细菌基因组为模板，分别采用步骤⑶中的六对特异性荧光定量PCR 引物进行荧光定量PCR扩增，得到不同样品荧光定量PCR的ct值，带入步骤⑷中计算出的 相应标准曲线方程中计算出拷贝数，通过换算即可得到单位粪便样品中各种乳杆菌的量； (6) 比较在摄入混合菌液/菌粉前后的受试者粪便中的乳杆菌含量，即得菌株在肠道的 定植能力。2. 根据权利要求1所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑴ 中混合菌液/菌粉为含有植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆 菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的混合菌液/菌粉； 或者，所述步骤⑴的具体步骤如下：分别制备植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、 鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌菌粉，平板计数计算菌粉中 活菌数，制备含有六种乳杆菌的混合菌液/菌粉，保证其中每种菌的浓度相同，混合菌粉 于-20°C保存备用。3. 根据权利要求2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤(3) 中选择植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌 这六种乳杆菌的相应的特异性荧光定量PCR引物的具体步骤如下： 通过NCBI检索得到植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆 菌、保加利亚乳杆菌的16S rRNA序列，通过比对这些序列，找到一种乳杆菌与其他乳杆菌有 差异的可变区序列，根据这些序列采用premier 5. O软件设计特异性引物，使用该引物能 特异性的扩增出该种类的乳杆菌，达到定量检测的目的。4. 根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步 骤⑴的具体步骤为： 以一定量六种不同乳杆菌混合菌粉或菌液喂食受试者，喂食2-4周之后，停止摄入 乳杆菌，收集摄入乳杆菌前及停止摄入乳杆菌后不同阶段的受试者新鲜粪便100_200mg， 于-80°C冰箱中保存、备用。5. 根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步 骤⑶中特异性荧光定量PCR引物是分别针对植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖 乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的特异性PCR引物，这六对引物能特 异性扩增出该种乳杆菌16S rRNA中的特异性片段，这六对引物分别为SEQ1、SEQ2、SEQ3、 SEQ4、SEQ5、SEQ6、SEQ7、SEQ8、SEQ9、SEQlO、SEQll、SEQl2。6. 根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步 骤⑶中对六对特异性荧光定量PCR引物的扩增特异性的检测，步骤如下： 第一步：准备六种乳杆菌的纯培养物，进行细菌基因组的提取，细菌基因组提取方法如 下： ① 取培养过夜后的六种菌液l_2ml至EP管中，lOOOOr/min离心2min，弃上清得菌体； ② 加入l-2ml无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心2min，弃上清得菌体； ③ 加入200ul SDS裂解液，混匀后在65-80°C恒温保温20-30min ; ④ 加入200-300ul酚-氯仿于菌体裂解液中，颠倒混匀后12000r/min离心5-10min，取 上清200ul ; ⑤ 加入400_500ul冰乙醇于200ul上清液中，_20°C静止30_50min之后，12000r/min离 心5-10min，弃上清； ?加入500111 70%冰乙醇重悬沉淀，1200(^/111111离心1-3111111，弃上清，常温干燥； ⑦用50-100ulCldH2O溶解沉淀，即得乳杆菌基因组，之后于-20°C保存、备用； 第二步：以得到的乳杆菌基因组为模板，采用六对特异性荧光定量PCR引物进行普通 PCR，分别对六对特异性荧光定量PCR引物的特异性进行PCR检测； 其中，PCR 体系 50yL:10Xbuffer 5yL;DNTPs 5yL;上游引物 20ymol/L IyL; 下游引物 20 ymol/L I y L ;Taq DNApolymerase 250U 0? 5 y L ;模板 DNA I y L ;ddH20 36. 5 u L ； PCR程序如下：①94°C预变性3min ;②94°C变性30s ;③60°C变性30s ;④72°C延伸 30s ;⑤②~④循环30次；⑥72°C延伸2min ;对扩增产物进行琼脂糖电泳，如果一种乳杆 菌引物只特异性扩增出相应的菌种基因组中的DNA片段，不扩增出其他菌种DNA片段，即表 明该特异性荧光定量PCR引物具有较好扩增特异性，能抵抗同属不同种乳杆菌的干扰，能 够用于后期定量检测。7. 根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步 骤⑵中的奠便中细菌基因组的提取采用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒提取奠便基因 组，具体操作方法如下： ① 称取100-200mg粪便样品于裂解介质管中，加入978ul磷酸盐缓冲液和122ul MT缓 冲液； ② 将裂解介质管在快速核酸提取仪上破碎、混匀，以6m/s的速度处理20s，处理2次； ③ 将裂解介质管于14000G的转速下离心5-10min，以破碎菌体；取离心的上清转移至 干净的2ml离心管中，加入250ul PPS溶液，于手中振荡10次混匀； ④ 将2ml离心管于14000G的转速下离心5min，之后转移上清至干净的15ml离心管中； ⑤ 重悬娃土结合液之后加入1ml至上述15ml离心管中；在振荡器上振荡2min使娃土 与DNA结合，静置3min使娃土沉淀； ⑥ 小心地吸除500ul上清，避免接触到硅土结合液；重悬剩余的硅土结合液和残余的 上清，转移600ul重悬的液体至过滤管中，14000G离心lmin，清空接收管中液体，加入剩余 的硅土结合液和残余的上清并离心，清空接收管中液体； ⑦ 加入500ul采用无水乙醇稀释8倍后的盐酸乙醇洗脱母液，用移液器吹打均匀；之后 于14000G条件下离心lmin，清空接收管，重复离心一次，以去除剩余液体； ⑧ 将过滤管换到新的接收管中，室温干燥5min ; ⑨ 加入50-100ul DNA洗脱液溶液，14000G离心lmin，得到粪便基因组，于-20°C保存， 备用。8. 根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述 步骤⑷中以稀释后的产物为模板进行荧光定量PCR，PCR体系20ul :2XSYBR染料预混液 IOul ;上游引物Iul ;下游引物Iul ;DNA模板Iul ;ddH20 Iul ;PCR程序如下：①95°C预变 性3min ;②95°C变性5s ;③60°C变性30s ;④72°C延伸IOs ;⑤步骤②~步骤④循环40 次；⑥熔解曲线，65°C -95°C，0. 5°C /2-5s。9. 根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步 骤⑶中荧光定量PCR扩增的具体操作步骤如下： PCR体系20ul :2XSYBR染料预混液IOul ;上游引物Iul ;下游引物Iul ;DNA模板Iul ;CldH2Olul;PCR程序如下：①95°C预变性3min;②95°C变性5s;③60°C变性30s;④ 72°C延伸IOs;⑤步骤②~步骤④循环40次；⑥熔解曲线，65°C -95°C，0. 5°C /2-5s。10. 根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步 骤(6)的具体判断方法如下： 将停止摄入乳杆菌后2~14天的受试者粪便中各种乳杆菌的量，与摄入乳杆菌之前的 水平进行比较，高于之前的菌量即表示定植，由此能够得到每株乳杆菌的肠道定植时间，进 一步地能够定量比较每株菌的定植量。
【专利摘要】本发明涉及一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法，包括如下步骤：⑴收集摄入混合菌液/菌粉后的受试者的粪便样品；⑵进行粪便中细菌基因组的提取，得粪便细菌基因组；⑶选择特异性荧光定量PCR引物，并检测其扩増特异性；⑷分别采用上述六种乳杆菌的细菌基因组为模板，分别制作六种乳杆菌拷贝数与ct值之间的标准曲线；⑸荧光定量PCR，得到ct值，通过换算即可得到单位粪便样品中各种乳杆菌的量；⑹比较在摄入混合菌液/菌粉前后的受试者粪便中的乳杆菌含量，即得菌株在肠道的定植能力。本方法基于荧光定量PCR，能够在较短的时间完成粪便样品中六种乳杆菌的快速准确定量，进而比较其肠道定植能力。
【IPC分类】C12R1/225, C12Q1/68, C12Q1/04, C12R1/25, C12R1/245
【公开号】CN105039578
【申请号】CN201510549782
【发明人】陈卫, 赵国忠, 王梦颖, 韩俊燕, 张灏, 赵建新, 田丰伟, 张秋香, 张白曦, 王刚, 刘小鸣, 郭敏
【申请人】江南大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月31日