生物传感器微阵列构成和方法
【专利说明】生物传感器微阵列构成和方法
[0001] 交叉参考
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请61/791，952的优先权，其 全文通过引用纳入本文。
[0003]发明背景
[0004] 蛋白质微阵列领域的当前状态促使以高密度形式从DNA微阵列中原位生产高质 量功能性蛋白质。目前的方法/技术包括，例如，核酸可编程蛋白质阵列（NAPPA)、蛋白质原 位阵列（PISA)、原位嘌呤霉素捕获、从DNA阵列到蛋白质阵列（DAPA)、纳米孔蛋白质阵列、 分析性微阵列（也称为捕获阵列）、功能性蛋白质阵列（也称为目标蛋白质阵列）、反相蛋 白质微阵列（RPPA)等。在无细胞的方法中，将编码cDNA、基因或质粒的微阵列打印在玻璃 基材上并与体外转录和翻译（IVTT)混合物孵育，以在使用时表达新鲜蛋白质。也可通过打 印先前表达的纯化蛋白质来生产蛋白质阵列，但这些蛋白质通常在表达、分离、纯化和打印 的费力过程中丢失3D构象依赖性的功能。原位生成的蛋白质阵列通过首次促进对于蛋白 质和蛋白质功能的高通量研究而彻底改变了蛋白质组学领域。也发现其可广泛地用于生物 标志物发现研究，发现亲和结合剂，抗体谱和临床验证研究。不幸的是，目前的生产蛋白质 阵列的方法都无法符合对于生成基于蛋白质的生物传感器的挑战和质量要求。
【发明内容】
[0005] 本发明描述了生物传感器微阵列，用于制备这类生物传感器微阵列的方法，以及 其使用方法。
[0006] 在一个方面中，本发明描述了一种生物传感器微阵列，其包含：（i)固体支持物基 材表面；（ii)与固体支持物基材表面连接的多个捕获部分；（iii)由这些捕获部分特异性 结合的多个检测多肽或检测肽；以及（iv)多个传感器；这些多个传感器中的每一个传感器 都直接接触或靠近多个捕获部分中的一捕获部分，且该生物传感器微阵列基本不含体外翻 译污染物。
[0007] 在一些实施方式中，这些检测多肽包括激酶、蛋白酶、磷酸酶、氧化酶、还原酶、聚 合酶、水解酶、裂解酶、转移酶、异构酶、连接酶、氧化还原酶、葡糖苷酶、糖苷水解酶、麦芽糖 糊精酶、脱氢酶、烯醇酶、分泌酶、合成酶、内切核酸酶、外切核酸酶、脂肪酶、加氧酶、纤维素 酶、环化酶、酯酶或其组合。
[0008] 在一些实施方式中，这些检测多肽或检测肽可逆地结合捕获部分。在一些实施方 式中，当检测多肽或检测肽可逆地结合捕获部分时，这些检测多肽或检测肽还包含可切割 接头，该接头的切割从捕获部分中释放检测多肽或检测肽。在一些实施方式中，该可切割接 头是蛋白酶可切割的接头（例如烟草黄边病毒（TEV)蛋白酶切割位点；肠激酶切割位点，凝 血酶切割位点，或HRV3C蛋白酶切割位点），光可切割的接头，或化学反应性可切割交联物。 在一些实施方式中，当检测多肽或检测肽可逆地结合时，这些捕获部分包含非共价亲和部 分。在一些实施方式中，这些检测多肽包含亲和素的氨基酸序列，且这些非共价亲和部分包 含脱硫生物素。
[0009] 在一些实施方式中，该生物传感器微阵列中的捕获部分包含抗体、生物素或卤代 烷烃脱卤酶标签多肽的配体。在一些实施方式中，这些捕获部分是抗体。
[0010] 在一些实施方式中，多个捕获部分与多个珠或纳米颗粒相连。
[0011] 在一些实施方式中，这些检测多肽或检测肽包含至少一种基材以进行酶促翻译后 修饰（例如酰化、乙酰化、去乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、酰胺化、糖基化、氧化、糖化、 磷酸化、生物素化、泛素化、SUM0化、类泛素化、硫酸化、PEG化、瓜氨酸化、去磷酸化、去酰胺 化或消除化（eliminylation))。
[0012] 在一些实施方式中，多个检测多肽或检测肽包含具有相同氨基酸序列的至少两种 多肽或肽，且该至少两种多肽或肽之一包含不具有翻译后修饰的相同氨基酸序列。
[0013] 在一些实施方式中，当捕获部分是抗体时，这些检测多肽或检测肽包含表位标签 且这些抗体特异性结合该表位标签。在一些实施方式中，该表位标签是谷胱甘肽-S转移酶 (GST)、卤代烷烃脱卤酶、MYC标签、FLAG标签、血凝素（HA)标签、6X-His标签或荧光蛋白。
[0014] 在一些实施方式中，多个检测多肽或检测肽包含人多肽、病毒多肽、细菌多肽、真 菌多肽、非人动物多肽、植物多肽或其组合。在一些实施方式中，这些检测多肽或检测肽包 含人多肽。在一些实施方式中，这些检测多肽或检测肽包含至少100条各自独立的人蛋白 序列（例如1000、5000、10000或20000条人蛋白序列）。在一些实施方式中，这些人检测多 肽或肽是癌相关多肽或肽。在一些实施方式中，这些检测多肽是病毒多肽、细菌多肽、真菌 多肽或其组合。
[0015] 在一些实施方式中，该生物传感器微阵列的基材表面是金、银、锗、铝或金属膜夹 心结构。
[0016] 在一些实施方式中，多个传感器包括场效应传感器、压电传感器、声波传感器、谐 振器或悬臂传感器。在一些实施方式中，这些场效应传感器包括半导体纳米线传感器、金属 纳米线、碳纳米管、纳米线、基于石墨烯的装置、纳米带传感器、聚合物传感器、电阻式传感 器、电容式传感器、电感式传感器、巨磁电阻传感器或其组合。
[0017] 在其他实施方式中，多个传感器包括等离子体传感器、量热传感器、电势传感器、 电流传感器、电导传感器、离子通道传感器、离子敏感型传感器或基于阻抗光谱的传感器。
[0018] 在一些实施方式中，多个检测多肽包含至少100种不同蛋白质的氨基酸序列。
[0019] 在一些实施方式中，多个传感器中的一些传感器直接接触或靠近多个捕获部分中 的各捕获部分。在一些实施方式中，所述一些传感器包括具有不同形状、不同尺寸、不同厚 度、不同表面结构、不同表面化学或不同电特性的传感器。在一些实施方式中，所述一些传 感器中至少一种是参比传感器。
[0020] 在一些实施方式中，多个传感器包含纳米结构、纳米模式、微米结构、微米模式、中 间结构、中间模式、纳米多孔或微米多孔的传感器表面。
[0021] 在一个相关的方面中，本发明描述了一种生物传感器微阵列试验，其包括以下步 骤：（i)使上述生物传感器微阵列与包含一种或多种分析物的样品接触，至少一种分析物 与生物传感器微阵列的多个检测多肽或检测肽中至少一种结合的检测多肽或检测肽的特 异性结合或相互作用或反应生成可检测信号；以及（ii)检测和测定至少一种分析物与至 少一种检测多肽或肽结合或相互作用或反应相关的信号水平。
[0022] 在该方法的一些实施方式中，在样品中检测至少十种不同分析物。在一些实施方 式中，至少一种待检测分析物是蛋白质、酶、抗体、非肽药物候选物、代谢物或核酸。在一些 实施方式中，这些分析物包含一种或多种待检测抗体。在一些实施方式中，该样品是来自人 对象的生物样品。在一些实施方式中，当样品是来自人对象的包含抗体的生物样品时，该方 法还包括基于一种或多种抗体的存在或水平显示是否存在身体病症。
[0023] 在其他实施方式中，一种或多种分析物包含分子量为约100道尔顿至约900道尔 顿的药物候选化合物。
[0024] 在该方法的其他实施方式中，一种或多种检测多肽或检测肽可逆地结合捕获部 分。在一些实施方式中，当一种或多种检测多肽或检测肽可逆地结合捕获部分时，该方法还 包括在使生物传感器微阵列接触样品前释放这些可逆结合的检测多肽或肽。
[0025] 在另一个方面中，本发明描述了一种生物传感器微阵列，其包含：（i)固体支持物 基材表面；（ii)与固体支持物基材表面连接的多个捕获部分；（iii)由这些捕获部分结合 的多个反应性多肽，各结合的反应性多肽都具有在目标配体存在的情况下相互作用或反应 以生成报告剂的活性；以及（iv)在目标配体或报告剂存在的情况下生成可检测信号的多 个传感器；这些多个传感器中的每一个传感器都直接接触或靠近多个捕获部分中的一捕获 部分，且该生物传感器微阵列基本不含体外翻译污染物。
[0026] 在一些实施方式中，多个传感器位于除连接有多个捕获部分的固体支持物基材以 外的固体支持物基材表面上。
[0027] 在一些实施方式中，通过反应性多肽生成的报告剂是非荧光的。在其他实施方式 中，该配体或报告剂是反应性或氧化还原物质，其生成可检测的电荷传输。在一些实施方式 中，该报告剂是报告多肽。在一些实施方式中，该报告多肽是被多个反应性多肽中一种或多 种反应性多肽翻译后修饰的多肽。
[0028] 在其他实施方式中，该生物传感器微阵列还包含特异性结合报告剂的多个捕获部 分。
[0029] 在其他实施方式中，多个传感器还包含对报告剂的存在敏感的包被层（coated layer)。在一些实施方式中，该涂层包含有机单层、生物分子单层、无机单层、多层膜、金属 膜、介电膜或半导体膜。
[0030] 在其他实施方式中，该配体或报告剂与传感器表面上沉积的另一种化学或生物单 层或多层或膜或有机或无机或介电或金属或绝缘体或拓扑绝缘体或半导体膜反应，导致传 感器中的响应。
[0031] 在一个相关的方面中，本发明描述了一种生物传感器微阵列试验，其包括：（i)将 上述生物传感器微阵列与包含一种或多种目标配体的测试样品接触，使得一种或多种目标 配体与一种或多种反应性多肽的反应生成报告剂；以及（ii)检测和测定报告剂的信号水 平。
[0032] 在另一个方面中，本发明提供了一种生成生物传感器微阵列的方法，其包括：（i) 提供多个捕获部分，其与固体支持物基材表面相连，其中多个传感器直接接触或靠近多个 捕获部分；（ii)提供经排列的体外翻译反应，其包含编码多种检测多肽的RNA、核糖体和从 RNA翻译得到的多种检测多肽；（iii)使经排列的体外翻译反应与多个捕获部分接触，使得 多种检测多肽特异性结合捕获部分的阵列；以及（iv)清洗接触的捕获部分以除去非特异 性结合捕获部分的体外翻译污染物，从而获得基本不含体外翻译污染物的生物传感器微阵 列。
[0033] 在上述方法的一些实施方式中，多个体外翻译反应包括至少100 (例如500、1000、 5000或10000)个体外翻译反应，其中各体外翻译反应包含的多肽的氨基酸序列与其他翻 译的检测多肽不同。
[0034] 在一些实施方式中，经排列的体外翻译反应排列于微米孔或纳米孔中。
[0035] 在一些实施方式中，待生成的生物传感器微阵列中的多个传感器包括场效应晶体 管（FET)传感器。
【附图说明】
[0036] 图1是多种类型的生物传感器及其检测形式的示意图。
[0037] 图2(上图）是