、中间结构、中间模式、纳米多孔或微米多孔表面的传感器。
[0085] 在多个实施方式中，各传感器与其相应检测多肽之间的距离范围是至少lnm至约 1mm，例如 10nm、100nm、lOOOnm、10,OOOnm、100,OOOnm或 500,OOOnm或至少lnm至约 1mm之 间另一距离，这取决于具体的检测方式。例如，当分析物是待检测的目标配体时（所述检测 是间接通过本发明所述可扩散报告剂的生成进行的），检测多肽与传感器的位置之间的距 呙可更长。
[0086] 上述生物传感器微阵列可通过检测多肽与感兴趣的分析物之间的直接相互作用 检测是否存在分析物（例如多肽、小分子量药物或碳水化合物）。或者，可通过检测多肽与 目标配体直接相互作用所生成的副产物或"报告剂"来检测分析物。
[0087] 在一些实施方式中，当生物传感器微阵列对报告剂敏感时，该报告剂是非焚光的。 在一些实施方式中，该报告剂是反应性或氧化还原或带电荷或极化或磁性物质，其生成可 检测的电荷传输。在一些实施方式中，该报告剂是报告多肽。在一些实施方式中，该报告剂 是被多个反应性多肽中一种或多种反应性多肽翻译后修饰的多肽。在一些实施方式中，反 应性多肽用作目标配体（如蛋白激酶）的底物（如蛋白激酶底物），并在与目标配体本身反 应后成为报告多肽。
[0088] 在一些实施方式中，当生物传感器微阵列配置为检测报告剂时，其还包含特异性 结合该报告剂的捕获部分，该报告剂是例如翻译后修饰的蛋白质或肽或样品中目标配体与 生物传感器微阵列中存在的反应性多肽相互作用所生成的蛋白水解片段。在其他实施方式 中，生物传感器微阵列包含多个传感器，这些多个传感器也包含对是否存在报告剂（如磷 酸基团部分或其他离子）敏感的包被层。参见例如图13 (下图）。例如，可使用磷酸亲和试 剂（含有Ga(III)、Fe(III)、Zn(II)和A1 (III)金属离子的膜）包被传感器，使得磷酸化的 产物蛋白质通过该磷酸亲和试剂（金属离子）与传感器结合以生成可检测信号。在一些实 施方式中，该包被层包含有机单层、双分子单层、无机单层、多层膜、介电膜或半导体膜。
[0089] 在一些实施方式中，该生物传感器微阵列包含绝缘表面（如金或锗或铝表面）以 使用电化学氧化还原、其他电子输送过程来间接检测和定量分析物-检测多肽。
[0090] 在一些实施方式中，多个传感器包括压电传感器或声波传感器（SAW)，谐振器，悬 臂传感器或电化学膜包被的压电传感器，如石英（QCM)，硅悬臂传感器（其频率不同，例如 共振频率变化），其用于检测与目标物质的相互作用。
[0091] 在一些实施方式中，当该生物传感器微阵列以纳米颗粒或珠的形式提供时，多个 传感器包括量子点或磁性颗粒。
[0092] 方法
[0093] 生物传感器微阵列的生成
[0094] 本发明所述任何生物传感器微阵列都可通过包括以下步骤的方法生成：（i)提 供多个捕获部分，其与固体支持物基材表面相连，其中多个传感器直接接触或考考多个捕 获部分；（ii)提供经排列的体外翻译反应，其包含编码多种检测多肽（或反应性多肽）的 RNA、核糖体和从RNA翻译得到的多种检测多肽；（iii)使经排列的体外翻译反应与多个捕 获部分接触，使得多种检测多肽特异性结合捕获部分的阵列；以及（iv)清洗接触的捕获部 分以除去非特异性结合捕获部分的体外翻译污染物，从而获得基本不含体外翻译污染物的 生物传感器微阵列。
[0095] 在一些实施方式中，这些排列的体外翻译反应包括至少100个体外翻译反应，其 中，各体外翻译反应包含的多肽的氨基酸序列与其他翻译的检测多肽不同。在一些实施方 式中，这些排列的体外翻译反应包括至少100至100, 〇〇〇个体外翻译反应（IVT)，例如200 个IVT、300 个IVT、400 个IVT、500 个IVT、1，000 个IVT、2, 000 个IVT、3, 000 个IVT、5, 0000 个IVT、7, 000 个IVT、8, 000 个IVT、20,000 个IVT、30,000 个IVT、40,000 个IVT、50,000 个 IVT、60, 000 个IVT、70, 000 个IVT、80, 000 个IVT、90, 000 个IVT，或至少 100 个IVT至约 100, 000个IVT之间另一数量的IVT。在其他实施方式中，这些排列的IVT包括至少3个 IVT至约 50 个IVT，例如 5 个IVT、8 个IVT、10 个IVT、15 个IVT、20 个IVT、30 个IVT、40 个 IVT，或至少3个IVT至约50个IVT之间另一数量的IVT。
[0096] 通常，用于生成本发明所述生物传感器微阵列的捕获部分是以单层形式提供的。 换言之，这些捕获部分（共价或非共价）结合于固体支持物基材表面。随后通常使捕获部 分包被的载玻片覆盖接触分离的体外翻译反应的阵列（例如在微米孔或纳米孔中）以特异 性捕获体外翻译的蛋白质（即检测多肽）以形成不含来自体外翻译翻译的污染物（例如核 糖体和核酸）的纯化的检测多肽的单层。参见图2-4。可通过本领域已知的多种方法中的 任一种生成阵列形式的检测多肽，包括但不限于：核酸可编程蛋白质阵列（NAPPA)、分离的 捕获或覆盖捕获、蛋白质原位阵列（PISA)和从DNA阵列到蛋白质阵列（DAPA)，特别是以纳 米孔阵列形式提供时。较高密度的微阵列降低了点样的蛋白质的空间分离。使用传统平面 载玻片的实验显示，当微阵列上各点之间中心至中心分隔距离小于400nm时，出现反应物 扩散的问题。虽然在750nm的间距时观察到最小扩散，但当点间隔降低至375nm时出现显 著扩散。
[0097] 在一些实施方式中，体外翻译排列在可密封的纳米孔中，各纳米孔的直径约250 微米且深度为75微米，各孔之间中心至中心的距离为至少400nm至约lOOOnm。在一些实施 方式中，这些体外翻译阵列以硅晶片上制造的纳米孔阵列形式提供。
[0098]参见例如Takulapalli等（2012)，J.ProteomeRes.，（8)，第 4382 - 4391 页。将 捕获部分（例如多肽，如抗体，或亲和素）连接至金属基材表面（如金）的方法是本领域 已知的，参见例如Moth-Poulsen等（2010)，BioconjugChem, 21 (6) : 1056-1061 ;Yang等 (2005)，Langmuir, 21(5):1858-1865。
[0099] 在一些实施方式中，体外翻译反应以微米孔阵列的形式提供，一个微米孔的尺寸 范围可以是直径约300nm至直径约lOOOnrn。
[0100] 生物传感器微阵列试验
[0101] 在多个实施方式中，本文所述生物传感器微阵列用于多种应用以检测样品中是否 存在一种或多种分析物。在多个实施方式中，一种生物传感器微阵列试验，其包括：（i)使 本文所述生物传感器微阵列接触包含一种或多种待检测分析物的测试样品，其中，至少一 种分析物与生物传感器微阵列中检测多肽或检测肽的特异性结合或相互作用或反应生成 可检测信号；以及（ii)检测和测定至少一种分析物与至少一种检测多肽或肽结合或相互 作用或反应相关的信号水平。
[0102] 在其他实施方式中，其中使用反应性多肽配置生物传感器微阵列以生成并检测 报告剂，该方法包括以下步骤：（i)使生物传感器微阵列接触包含一种或多种配体的测试 样品，其中，一种或多种目标配体与一种反应性多肽的相互作用或反应生成报告剂；以及 (ii)检测和测定该报告剂的信号水平。
[0103] 在一些实施方式中，该信号通过场效应生成并经由基于场效应晶体管（FET)的传 感器转换。参见例如图5。
[0104] 合适的测试样品包括但不限于：生物样品（例如全血、血清、血液部分、痰液、尿 液、活检样品和粗裂解物）；纯化的化合物（例如小分子药物候选化合物）；小分子化合物 文库；细胞培养物蛋白质提取物或用过的培养基上清；细菌培养物；以及植物提取物。
[0105] 在一些实施方式中，在待测定样品中检测至少1-500种分析物，例如至少1、2、4、 5、7、10、15、20、30、50、75、100、150、200、300、400、450 或其他数目的待测定分析物。在一些 实施方式中，在样品中检测至少十种不同分析物。在一些实施方式中，在样品中检测至少 5000种不同分析物。在一些实施方式中，在样品中检测至少100, 000种不同分析物。在一 些实施方式中，在样品中检测至少十种不同分析物。
[0106] 在一些实施方式中，至少一种分析物是蛋白质、抗体、非肽药物、代谢物或核酸。在 一些实施方式中，一种或多种待检测分析物包含分子量为约100道尔顿至约900道尔顿的 药物候选化合物。例如，在通过表型筛选鉴定药物候选物时，鉴定的药物候选物的作用模式 和/或靶标是未知的。因此，这些生物传感器微阵列和微阵列试验对于鉴定药物候选物的 靶标而言非常有用，具体方法为检测药物候选物与传感器微阵列中检测多肽的相互作用， 或者检测这类相互作用生成的副产物（即报告剂）。
[0107] 在一些实施方式中，待检测分析物是与身体病症（例如癌症、感染性疾病或自身 免疫疾病）相关的多种抗体。实际上，在生物样品中存在多种抗体提供了疾病相关诊断"特 征"。参见例如图11-12。
[0108] 在一些实施方式中，该生物传感器微阵列用于定量测试样品中一种或多种分析物 与相应检测多肽之间相互作用的动力学速率。在其他实施方式中，该生物传感器微阵列使 用评估蛋白质-蛋白质相互作用或对蛋白质活性的抑制。例如，当检测多肽是蛋白激酶底 物或具有自身磷酸化活性的激酶时，可在已知或推定的特定磷酸激酶活性抑制剂存在或不 存在的情况下检测磷酸激酶活性（参见例如图6-7)。这还可用于分析蛋白激酶抑制剂的特 异性，其中多种不同的蛋白激酶是检测多肽，可在推定的激酶抑制剂存在或不存在的情况 下定量其相对活性以测定测试的激酶抑制剂化合物的特异性。此外，当激酶磷酸化的提高 与特定疾病状态相关时，可通过使本发明所述生物传感器微阵列接触相关生物样品并检测 一种或多种检测多肽的磷酸化来评估特定生物样品的激酶活性。蛋白激酶是多种身体病症 的重要靶标，例如癌症、肺动脉高血压、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病、CNS病、黄斑变性、 特发性肺纤维化、系统性硬化病、类风湿性疾病等，允许发现激酶抑制剂药物并将激酶功能 性筛选应用为疾病诊断学。
[0109] 在一些实施方式中，待使用的生物传感器微阵列包含检测多肽或反应性多肽，其 可逆地结合本发明所述捕获部分。在一些实施方式中，当检测多肽或反应性多肽可逆结合 时，该试验方法还包括在检测步骤前释放可逆结合的多肽的步骤。当报告剂的生