优化的靶向md-2的高效抗炎多肽的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明属生物医药领域，特别涉及经优化的靶向MD-2的高效抗炎多肽，以及所述多肽在制备用于治疗因感染造成相关的过度炎症性损害类疾病，如脓毒症的药物中的应用。【
背景技术：
】[0002]细菌感染，特别是革兰氏阴性菌感染所导致的脓毒症已成为当前临床病人，特别是外科ICU患者死亡的主要原因。细菌对机体造成的感染脓毒症通常由细菌外毒素及内毒素对机体的刺激产生。细菌毒素进入体内后，首先刺激免疫炎症细胞，通过机体模式识别受体，主要为TLR2和TLR4受体，启动机体的感染免疫反应，但当机体遭受过度刺激后，大量产生的炎症介质则可对机体造成一系列过度的炎症性损害。有鉴于此，采用恰当的免疫策略对脓毒症实施有效防治，已成为当前免疫学家、临床学家以及制药行业关注的重点问题之〇[0003]对各种疾病的治疗都应集中在发病早期环节上，免疫细胞对细菌内毒素脂多糖(lipopolysacchride，LPS)的识别是炎症反应发生的初始环节，如何调控免疫炎症细胞对LPS的识别，下调LPS所致的过度炎症反应，从而在减轻炎症性损害的同时，又不影响机体免疫细胞正常的抗感染免疫功能则应是针对脓毒症实施有效免疫治疗的理想策略。[0004]在免疫炎症细胞LPS的膜式识别受体复合物（TLR4/MD2/CD14)中，任何一个功能结构域的破坏都导致LPS信号转导障碍。资料证实，CD14与TLR4/MD2的亲和力较弱，而TLR4/MD2的亲和力较强，并且MD2(myeloiddifferentialprotein2,髓样分化蛋白2)同TLR4(tolllikereceptor4，Toll样受体4)的结合发生在同LPS结合之前，丧失LPS结合功能的MD2即使结合在TLR4胞外区，也不能赋予TLR4对LPS的反应性。表明MD2分子中与LPS结合的结构域对整个复合体的功能乃至之后的信号转导强度都有决定性的作用。并且，MD2与TLR4的胞外区相耦联，是一个只含有160个氨基酸的分泌蛋白，具有分子量小，核酸片段短，且为可分泌型等特点，对MD2的调控更易于操作，因而成为治疗内毒素休克十分有潜力的祀点之一。[0005]由于MD2在结合LPS及诱导其信号的胞内传导中都起着关键的作用。阻断LPS与MD2的结合，比阻断LPS与TLR4/MD2的结合要容易近100倍。因而发明人在申请号为CN200710092404.8的中国专利申请中已经成功筛选出2条针对MD-2的拮抗多肽：T6和Tl1，可部分阻断MD-2与LPS的结合。[0006]发明人通过上述前期研究，发现T6和Tll对MD-2与LPS结合的阻断的效率不高。为了获得具有更高抗炎活性的多肽，经过进一步研究证实，根据靶标蛋白在噬菌体展示肽库中筛选出阳性序列，再根据阳性序列构建突变肽库，进一步筛选靶标蛋白，筛选后得到的阳性克隆效果更佳。本研究旨在通过对原始多肽（MD-2拮抗多肽）进行突变多肽库的构建、筛选和功能鉴定，最终获得具有更高抗炎活性的多肽。[0007]目前在我国尚无准确的脓毒症发病率数据，但参考美国近期统计数据，每年脓毒症发生病例约为75万例，我国人口为美国人口4-5倍，加之我国目前的医疗条件与欧美发达国家相比尚有较大差距，推测我国每年发生脓毒症的病例约1千万例。因此，市场前景十分广阔。经推断，2014年度我国在抗感染方面实际费用大约为：4800亿元人民币。因此，有关脓毒症药物一旦全面推向市场，其经济效益不可估量。[0008]目前国内外医疗市场尚无直接针对脓毒症的发生、发展而研制的新型生物制剂，一旦完成基础和临床实验，获准进入临床应用，必将具有非常明显的社会效益和经济效益。【
发明内容】[0009]本发明的目的是提供一种优化的靶向MD-2的抗炎多肽，所述多肽包括如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列；优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。然而，本领域技术人员理解，可在SEQIDN0:6中天然产生或人工引入突变或变异（包括但不限于，置换，缺失和/或添加），所产生的变体保留其生物学特性。[0010]根据本发明，当在蛋白/多肽的背景中使用时，术语"变体"是指这样的蛋白，其氨基酸序列与参照蛋白/多肽（例如，本发明的优化的靶向MD-2的抗炎多肽）的氨基酸序列具有一个或多个（例如1-9个或1-5个或1-3个）氨基酸差异（例如，保守氨基酸置换），或者具有至少80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%的同一性，并且其保留了参照蛋白/多肽的必要特性。在本发明中，蛋白/多肽的必要特性可以指，靶向MD-2的抗炎特性。[0011]根据本发明，术语"同一性"用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时（例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据），那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的"百分数同一性"是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目XlOO的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性（总共6个位置中有3个位置匹配）。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序（DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人（1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序（版本2.0)的E.Meyers和W.MiIler(Comput.ApplBiosci.,4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一1性。此外，可使用已整合入GCG软件包（可在www.gcg.com上获得）的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重（gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。[0012]如本文中使用的，术语"保守置换"意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似（例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等）的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸）、酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、β分支侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的（参见，例如，Bru_ell等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文）。[0013]根据本发明，优化的靶向MD-2的抗炎多肽与其他蛋白的连接可包括例如融合和缀合等。特别地，优化的靶向MD-2的抗炎多肽可通过接头与其他蛋白连接。根据本发明，术语"接头"是指用于连接两个分子（例如蛋白）的短肽。通常，通过将编码该短肽的多核苷酸序列引入（例如，通过PCR扩增或连接酶）分别编码所要连接的两种目的蛋白的2个DNA片段之间，并进行蛋白质表达来获得融合蛋白，例如目的蛋白1-接头-目的蛋白2。如本领域技术人员公知的，接头包括但不限于柔性连接肽，例如Gly-Gly-Gly-Gly，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，Gly-Gly-Ser-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3O[0014]在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。[0015]在本发明中，术语"多肽"和"蛋白质"具有相同的含义，可互换使用。[0016]在另一个方面，本发明涉及编码优化的靶向MD-2的抗炎多肽、其变体或其融合蛋白的多核苷酸及含有该多核苷酸的载体。优选地，所述多核苷酸包含如SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。[0017]可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。[0018]在另一个方面，本发明还涉及包含上述多核苷酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞（如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等当前第1页1 2 3