。扩 增：其余的2. 3ml phage洗脱样品用于感染50ml对数早期的ER2738,37°C剧烈震荡培养 4. 5h，收集phage上清，沉淀浓缩后，用作下一轮筛选。重复2次，并将抗原huMD2依次降低 为：5以8、1以8。共筛选三轮。
[0084] 经过3轮筛选，每一轮结束后均记录噬菌体投入量及回收量，并计算回收率。结 果见表1。可见富集率随着筛选轮数的增加而增加，说明与MD2蛋白具有结合活性的特异性 噬菌体克隆得到有效富集。
[0085] 表1用MD-2蛋白进行3轮亲和筛选中噬菌体回收率的改变
[0086]
[0087] 2. 2ELISA鉴定与MD2结合的噬菌体展示多肽
[0088] 从2. 1获得的噬菌体克隆中挑选94个克隆进行ELISA，以MD2为实验组，BSA为对 照组，鉴定噬菌体展示多肽与MD2的结合力。采用SPSS17. 0软件包处理各组数据，以x±s 表示，进行t检验和单因素方差分析，两两比较采用LSD比较，p〈0. 05为差异具有统计学意 义。本发明实施例所有数据均采用相同方法进行统计处理。
[0089] 结果显示5个噬菌体克隆所展示的多肽与MD2全长蛋白有较高的结合力，OD45。值 高于0. 5,且均高于原始展示多肽T6、Tll的克隆（结果见图2)。
[0090] 2. 3阳性克隆中噬菌体展示多肽的DNA测序
[0091] 从结合活性高于Τ6、Tll对照组的5个噬菌体克隆提取单链DNA，进行DNA测序， 并推导DNA序列编码的氨基酸，即为噬菌体表达的多肽序列，5个克隆呈现出5种不同编码 的氨基酸序列。
[0092] 测序结果：
[0093] >MD-A8 ：AGGCGGCGCAACACTAGGACCACTCTTATACGG(SEQ ID NO：I)
[0094] >MD-F5 ：AGTAAAAGTAGTATTCCAACCAGGATGCTGATG (SEQ ID NO ：3)
[0095] >MD-H2 ：AAGCGCAAGATGAGGATGAATACGAGGCGCCTG(SEQ ID NO ：5)
[0096] >MD-H5 ：CGCAAACCTAAGCTTAGCCGTAGGCATATTCGA(SEQ ID NO ：7)
[0097] >MD-H9 ：CATACACGCATGACGAGGAGCCGGCTTCACACA(SEQ ID NO ：9)〇
[0098] 对应的氨基酸序列：
[0099] >MD-A8 ：RRRNTRTTLIR(SEQ ID NO ：2)
[0100] >MD-F5 ：SKSSIPTRMLM(SEQ ID NO：4)
[0101] >MD-H2 ：KRKMRMNTRRL(SEQ ID NO ：6)
[0102] >MD-H5 ：RKPKLSRRHIR(SEQ ID NO ：8)
[0103] >MD-H9 :HTRMTRSRLHT(SEQ ID NO :10)。
[0104] 实施例3、细胞因子生成抑制试验
[0105] 3.1细胞培养
[0106] RAW264. 7购自ATCC，人前单核细胞（THP-I)由第三军医大学野战外科研究所第四 研究室惠赠。RAW264. 7细胞和THP-I细胞用含10 %胎牛血清的RPMI 1640完全培养基培 养，THP-I细胞需经佛波醇乙酯（Phorbol myristate acetate, PMA)刺激后才能分化为单 核巨噬样细胞。THP-I经培养和计数后，加入PMA100ng/ml共同培养24h，调整细胞计数为 I X IO5个/孔。RAW264. 7直接调整细胞计数为I X 10 5个/孔。
[0107] 3. 2初筛5个克隆对RAW264. 7以及THP-I的细胞因子生成抑制效果的测定
[0108] RAW264. 7以及PMA诱导后的THP-I以PBS液洗涤3遍后用含10 %胎牛血清的1640 培养液调整细胞浓度为IX IO5个/孔。设3个对照组：I组为control组（RAW264. 7/诱导 后的 THP-1)、II 组为 LPS 组（RAW264. 7/ 诱导后的 THP-1+LPS)、111 组为 M13 组（RAW264. 7/ 诱 导后的THP-1+LPS+对照组噬菌体Μ13)，实验组为RAW264. 7/诱导后的THP-1+LPS+噬菌体 克隆（A8、F5、H2、H5、H9)。各组LPS的终浓度均为1 μ g/ml。孵育6h后收集上清液，-20°C 冰箱保存待测。按ELISA试剂盒说明测定TNFa。多肽药物浓度均为200ug/ml。实验发现 其中A8, H2有较好的抑炎作用，而F5、H5、H9均无明显抑制炎症的效果（结果见图3)。
[0109] 3. 3优化多肽A8、H2与原始多肽T6、T11对RAW264. 7以及THP-I的细胞因子生成 抑制效果的比较
[0110] 将初步筛选出的优化多肽Α8、Η2以及原始多肽Τ6、Tll序列送往上海锐劲生物 技术有限公司进行多肽合成。以RAW264. 7以及THP-I细胞模型为靶细胞，多肽浓度采用 200ug/ml，通过细胞因子生成抑制实验，比较优化多肽Α8、Η2与原始多肽Τ6、Tll对细胞的 抗炎效果。结果证实，A8、H2对细胞的抑炎效果比原始多肽更好，提高了近一倍（结果见图 4)〇
[0111] 实施例4、动物模型中优化多肽A8、H2与原始多肽T6、Tll抗炎活性的比较
[0112] 用6-8周龄雄性C57小鼠，体重20-22g。将小鼠分为6组（η = 5)，2个对照组（η =5)，I组（空白对照）：每只小鼠腹腔注射Iml生理盐水；II组（阴性对照）：每只小鼠腹 腔注射Iml LPS(400ug/ml)的盐溶液；4个实验组：实验组分为4条多肽（T6，T11，A8，H2)， 每只小鼠在用LPS处理前Ih分别注射多肽（200ug/ml)。在LPS注射后6h脱颈处死小鼠。 抽取血液，血清贮存于-20°C待测。ELISA检测炎症因子TNF α和IL-6含量。
[0113] 优化多肽Α8、Η2中只有一条Η2有明显强于原始多肽Τ6、Τ11抑炎效果（结果见图 5) 〇
[0114] 尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
【主权项】
1. 一种靶向MD-2的抗炎多肽，特征在于，其包含： 1) 如SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列； 2) 1)中所定义的氨基酸序列的变体，所述变体与1)中所定义的氨基酸序列的不同在 于缺失、替代、和/或添加了 1 一 9个氨基酸残基，并具有靶向MD-2的抗炎活性；或 3) 1)中所定义的氨基酸序列的变体，所述变体与1)中所定义的氨基酸序列具有至少 90% (如至少 91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或99%)的同一性，并具有靶 向MD-2的抗炎活性； 例如，2)或3)中所定义的变体与1)中所定义的氨基酸序列的不同在于一个或多个保 守氨基酸置换，例如1 一 9个保守氨基酸置换； 优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :6所示。2. -种融合蛋白，其包含权利要求1所述的多肽。3. 编码权利要求1所述多肽或权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸；优选地，所述多 核苷酸包含如SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列；优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :5 所示。4. 包含权利要求3所述多核苷酸的载体。5. 包含权利要求3所述多核苷酸或权利要求4所述载体的宿主细胞。6. 权利要求1所述多肽、权利要求2所述融合蛋白或权利要求3所述多核苷酸在制备 治疗感染引起的过度炎症性损伤的药物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述感染为革兰氏阴性菌所致。8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述感染引起的过度炎症性损伤为脓毒 症。9. 权利要求1所述多肽、权利要求2所述融合蛋白或权利要求3所述多核苷酸在制备 抑制炎症因子生成的药物中的应用.10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述炎症因子为TNF a和/或IL-6。11. 权利要求1所述多肽、权利要求2所述融合蛋白或权利要求3所述多核苷酸在制备 治疗由脂多糖通过TLR/MD2所诱导的炎症疾病的药物中的应用。12. 根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述炎症疾病为脓毒症。13. -种药物组合物，其包含权利要求1所述多肽、权利要求2所述融合蛋白或权利要 求3所述多核苷酸。
【专利摘要】以T6、T11为基础，采用NNK策略构建突变肽库，以MD-2全长蛋白为靶蛋白，通过对突变肽库进行亲和筛选，得到高亲和力的噬菌体克隆。通过细胞因子生成抑制实验和检测动物血清中的炎性介质的表达，发现1个噬菌体克隆所展示的融合肽可以模拟MD-2的抗炎多肽，其氨基酸序列为KRKMRMNTRRL。其与MD2全长蛋白的结合高于原始T6、T11克隆，能够显著减轻脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞合成和释放炎症介质，具有明显强于原始多肽的抗炎效果。
【IPC分类】C07K7/06, C07K19/00, A61P31/04, C12N15/11, C12N15/62, A61K38/08, A61K48/00, A61P29/00
【公开号】CN105061559
【申请号】CN201510408969
【发明人】闫红, 李磊, 谭燕, 吴晓凤
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第三附属医院
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月13日