玉米zmERF18基因启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及玉米zmERFIS基因启动子及其应用。
【背景技术】
[0002] 到本世纪中期，全球人口将达到90亿，急需农作物的增产、稳产，来满足人口日益 增长的需求。玉米是我国种植面积最大的作物，然而在我国南方及东南亚地区，局部地区的 洪涝灾害，给玉米的生产带来了严重的损失。仅南亚，每年超过15 %的玉米种植面积遭受不 同程度的危害。在印度，洪涝灾害造成玉米每年减产25-30%。我国南方春玉米和北方夏玉 米在正常的栽培季节中，经常遭受洪涝和渍害，玉米根系长期处于低氧状态，导致玉米减产 10%-40%。涝渍害已成为我国南方玉米高产、稳产的主要制约因子之一。因此，克隆玉米 淹水胁迫响应基因及其启动子，对阐明玉米淹水胁迫响应形成的分子机理以及玉米和其他 旱生作物耐涝渍的遗传改良，具有十分重要的理论价值和实践意义。
[0003] 研究表明，ERF基因广泛参与植物的非生物胁迫响应。水稻的SublA、SN0RNEL1、 SN0RKEL2,以及拟南芥中的RAP2. 2等，这些重要的淹水胁迫响应基因，都是ERF家族基因。 课题组前期的研究，发掘了玉米淹水胁迫响应相关的ERF基因。因此，克隆这些参与淹水响 应的ERF基因的启动子，有助于阐明玉米耐渍性形成的分子机制，同时为玉米及其他旱生 作物的耐渍遗传改良提供理论指导。然而，玉米ERF基因启动子的克隆，目前，尚未见有报 道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供玉米zmERF18基因启动子，并提供zmERF18基因启动子在 植物耐渍遗传改良中的应用。
[0005] 本发明第一方面提供了玉米zmERF18基因启动子，其具有：
[0006] (l)SEQ ID No:l所示的核苷酸序列；或
[0007] (2)SEQ ID N〇:l所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且同等功 能的由（1)衍生的核苷酸序列。
[0008] 本发明第二方面提供了含有玉米zmERFIS基因启动子的载体。
[0009] 本发明第三方面提供了玉米zmERF18基因启动子在植物的耐渍性改良中的应用。
[0010] 本发明第四方面提供了玉米zmERFIS基因启动子在制备转基因植物中的应用。
[0011] 本发明的有益效果是：（1)玉米zmERFl基因启动子直接驱动外源基因的转基因植 物，淹水条件下4h内快速高效启动外源基因在植株根部的大量表达，可以提高植株的耐渍 性，或抗虫、抗病等能力；2)玉米zmERFl基因启动子是只在根部特异表达的组织特异性启 动子，所以对于食用非根部的转基因植物，不存在转基因食品安全问题；（3)玉米zmERFl基 因启动子的启动能力较强，是强启动子；(4)为玉米及其他旱生作物的耐渍性遗传改良提 供了新的根部特异表达、淹水诱导型的启动子资源；（5)对该启动子中所含顺式元件的分 析，可进一步阐明玉米耐渍性形成的分子机制，具有十分重要的理论价值和实践意义。
【具体实施方式】
[0012] 本发明第一方面提供了玉米zmERF18基因启动子，其核苷酸序列如SEQIDN〇:l 所示，序列全长1390bp，该启动子含有1个GARE、1个TC-richmotif、3个Skn_lmotif、l 个CGTCA-motif和1个MBS位点顺式元件，这些顺式元件与植物激素、厌氧胁迫响应相关； 是一个组织特异型的启动子，只在根系中表达；是一个诱导型的启动子，受淹水诱导高效表 达。
[0013] 玉米zmERF18基因启动子还包括根据SEQIDNo:l所示的核苷酸序列，对其取代、 缺失或添加一个或几个核苷酸，而衍生的具有相同功能的DNA片段。
[0014] 所述玉米zmERF18基因启动子是从玉米自交系Hz32中克隆获得的。
[0015] 本发明第二方面提供了含有玉米zmERF18基因启动子的载体。在本发明的实施例 中含有玉米zmERF18基因启动子的载体为pCAMBIA1300-zmERF18-GUS载体。
[0016] 本发明第三方面提供了玉米zmERF18基因启动子在植物的耐渍性改良中的应用。
[0017] 本发明第四方面提供了玉米zmERFIS基因启动子在制备转基因植物中的应用。
[0018] 例如，可以将玉米zmERF18基因启动子克隆到转化载体上，其后连接一个Tnos终 止子，构建成一个转化载体。将所转化的目的基因以正确的方向，克隆到玉米zmERFIS基因 启动子与Tnos终止子之间，构建好转化载体。然后通过基因枪轰击法或农杆菌法介导法将 目的基因转化到受体细胞中，通过组织培养等技术手段获得转基因植株。
[0019] 优选的，所述植物为旱生作物，更加优选的，所述植物为玉米、水稻。
[0020] 下面将结合实施例对本发明提供的玉米zmERFIS基因启动子及其应用予以进一 步说明。
[0021] 1、玉米zmERF18基因的获得
[0022] 使用生物信息学方法，对玉米全基因组进行分析，获得了 107个玉米ERF基因。使 用qRT-PCR技术，分析了这些基因在玉米自交系Hz32根系中的表达，结果发现zmERF18基 因在淹水处理l、2、4d，表达水平显著升高。说明该基因受淹水诱导表达，该基因的启动子是 淹水胁迫响应的诱导型启动子。植物的淹水胁迫受GA、乙烯等信号途径调控。因此，使用 GA、ACC处理Hz32幼苗，并检测了zmERF18基因的表达，结果显示该基因经GA、ACC处理，表 达水平显著提高，所述GA为赤霉素、ACC为促进剂1 一氨基环丙烷一 1 一羧酸。以上结果表 明，该基因受淹水、GA、ACC诱导表达，因此，我们把zmERF18基因确定为淹水胁迫响应候选 基因。
[0023] 2、玉米自交系Hz32叶片总DNA的提取
[0024] 将玉米Hz32的种子于培养箱中在28°C下发芽，取2.0g幼叶于液氮中充分研磨，并 转入50ml离心管中。向离心管中加入预热的CTAB缓冲液5ml，混勾，所述CTAB缓冲液包 括：1.17MNaCL、0.0016MEDTA-8.0,0.835MTris-7.5，1.6%CTAB，1% 疏基乙醇。在 65°C水浴锅内反应30分钟，不时轻摇离心管。取出离心管，待冷至室温后，加入5ml氯仿、 异戊醇混合液，其中氯仿与异戊醇体积比为24 :1，小心摇动试管10分钟。8000rpm离心10 分钟，将上清液转至另一 50ml离心管中。加4ml异丙醇，小心混匀，将棉絮状DNA转入盛 10ml70 %乙醇的50ml离心管中，浸泡12小时。倒掉70%乙醇，将DNA晾干，加入lmlTE溶 解。待0嫩完全溶解后，转入2.〇1111离心管中，加入1(^11〇11^/11118似864，混匀 ；在371€ 下，温育2小时。再用lml苯酚、氯仿、异戊醇混合液抽提一次，其中苯酚、氯仿、异戊醇的体 积比为25 : 24 :l，8000rpm离心10分钟。将上清液转入2.Oml离心管中，加入1/10上 清液体积的3MNaAC，所述NaAC的pH为5. 2,再加入2/3上清液体积的异丙醇沉淀DNA。将 棉絮状DNA转入2. 0ml离心管中，用70 %乙醇洗涤一次，短暂离心，使DNA贴壁，倒去70 % 乙醇，晾干DNA。待DNA晾干后，加入0. 5mlTE溶液，完全溶解DNA，于-20°C长期保存。
[0025] 3、zmE