RF18基因启动子的克隆
[0026] 根据玉米自交系B73zmERF18基因的启动子序列，设计一对特异引 物，左引物：5 'CACCCGTTGACGATGGTGAAAGGAGA3 '，即SEQIDNo:2;右引物： 5^TTGITGGCGGTGAGACATTAGG3'，即SEQIDNo:3。以Hz32 的DNA作为模板，使用高保真 Taq酶phusion进行PCR扩增。
[0027]PCR扩增反应体系为：5y1 10XPCR缓冲液，2y1 10mMdNTPs, 1y1 10mM特异左 引物，1y1 10mM特异右引物，1单位phusion酶，40ng模板DNA，加ddH20至总体积50y1。
[0028] PCR扩增程序为：95°C3分钟；95°C1分钟，58°C1分钟，72°C2分钟，循环35次； 72°C7分钟；4°C30分钟。
[0029] PCR扩增产物于1 %琼脂糖凝胶中120伏直流电压电泳45分钟，使用北京全式金 生物技术有限公司的凝胶回收试剂盒，回收特异DNA片段，后续将该DNA片段连接到pENT-D 载体上，进行DNA测序。所述pENT-D载体从北京全式金生物有限公司购买。
[0030] 4、转化载体的构建
[0031] 从凝胶中回收的PCR产物，克隆到pENT-D载体中，使用北京全式金生物技术有限 公司的pENT-D试剂盒进行反应，反应体系：40-50ngPCR产物，dilutedsalt(稀释的盐溶 液）1y1，pENT-D0? 5y1，加水至 6y1 ;
[0032] 反应产物混匀后以转速5000rpm离心1分钟，25°C放置1小时。将反应产物通过 电击法转化DH10B大肠杆菌感受态细胞，然后进行振荡培养，37°C培养1小时后，取出均匀 涂抹于含有l〇〇mg/Lkm的LB平板上，再将含有km的LB平板置于恒温箱中37°C培养20小 时。挑选单克隆，PCR检测、DNA测序，获得阳性克隆。获得的阳性克隆中提取质粒DNA，并 与PCAMBIA1300载体进行重组，然后将zmERF18启动子重组到pCAMBIA1300载体中，以获得 pCAMBIA1300-zmERF18-GUS载体，由市场上购得的pCAMBIA1300载体均适用于本发明。
[0033] 重组反应体系：pENT-D-zmERF182y1，pCAMBIA13002y1，Clonsell1y1，25。(： 1 小时；获得的重组产物电击法转入大肠杆菌DH10B感受态细胞后，均匀涂抹于含有lOOmg/L Amp(氨苄）的LB平板，然后将含有Amp的LB平板置于恒温箱中，37°C培养20小时。挑选 单克隆，采用碱变性提取法提取质粒DNA，用Notl、AscI双酶切检测，并用1 %琼脂糖凝胶分 析酶切图谱，选阳性克隆用于水稻的转基因；
[0034] 对所克隆的zmERF18基因启动子进行DNA测序，测得的DNA序列如SEQIDNO: 1 所示。
[0035] 该启动子含有 1 个GARE、1 个TC-richmotif、3 个Skn-lmotif、1 个CGTCA-motif 和1个MBS位点顺式元件，这些顺式元件与植物激素、厌氧胁迫响应相关；是一个组织特异 型的启动子，只在根系中表达；是一个诱导型的启动子，受淹水诱导高效表达。该启动子与 抗虫、抗病、抗逆等目的基因连接，在淹水、涝渍条件下，可提高转基因植株根部的抗虫、抗 病、抗逆境能力。同时该启动子只在根部表达，不涉及食用转基因植物地上部分的食品安全 问题。zmERF18启动子在旱生植物的耐渍遗传改良中，具有很好的应用前景。
[0036] 5、转zmERF18启动子水稻植株的获得
[0037] 将pCAMBIA1300-zmERF18-GUS载体，转入到LBA4404农杆菌中。由武汉伯远生物 科技有限公司进行水稻的遗传转化，将zmERFIS启动子转化到水稻自交系Kittaka中。所 述LBA4404农杆菌菌株，由武汉伯远生物科技有限公司提供。
[0038] 6、zmERF18启动子活性的检测
[0039] 将转zmERFIS水稻于苗期进行淹水处理，将正常生长和淹水处理的转基因水稻幼 苗进行GUS组织化学染色。结果发现，在正常生长条件下，转zmERFIS启动子水稻植株的 根和叶片，未出现GUS染色的蓝色；而淹水条件下，转zmERFIS启动子水稻的根呈现较强的 ⑶S蓝色，叶片未见⑶S蓝色。研究表明zmERF18启动子既是一个在根中表达的组织特异型 启动子，同时也是一个淹水诱导表达的诱导型启动子。
[0040] zmERFIS启动子是淹水条件下诱导表达的诱导型启动子，其直接驱动外源基因的 转基因植物，淹水条件下4h内快速高效启动外源基因在植株根部的大量表达，启动能力较 强，是强启动子，可以提高植株的耐渍性，或抗虫、抗病等能力；zmERF18启动子直接驱动外 源基因的转基因植物，由于外源基因只在淹水条件下诱导表达，且表达部位仅局限于根部， 所以对于食用非根部的转基因植物，不存在转基因食品安全问题。
[0041] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 玉米zmERF18基因启动子，其特征在于：所述玉米zmERF18基因启动子具有： (1) SEQ ID No: 1所示的核苷酸序列；或 (2) SEQ ID N〇:l所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且同等功能的 由（1)衍生的核苷酸序列。2. 如权利要求1所述的玉米zmERF18基因启动子，其特征在于：所述玉米zmERF18基 因启动子是从玉米自交系Hz32中克隆获得的。3. -种载体，其特征在于：所述载体含有权利要求1或2所述的玉米zmERFIS基因启 动子。4. 权利要求1或2所述的玉米zmERF18基因启动子在植物的耐渍性改良中的应用。5. 权利要求1或2所述的玉米zmERF18基因启动子在制备转基因植物中的应用。6. 如权利要求5所述的玉米zmERF18基因启动子在制备转基因植物中的应用，其特征 在于：所述植物为旱生作物。7. 如权利要求6所述的玉米zmERF18基因启动子在制备转基因植物中的应用，其特征 在于：所述植物为玉米、水稻。
【专利摘要】本发明提供了玉米zmERF18基因启动子，其特征在于：所述玉米zmERF18基因启动子具有：(1)SEQ？ID？No.1所示的核苷酸序列；或(2)SEQ？ID？No.1所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由(1)衍生的核苷酸序列。该启动子直接驱动外源基因的转基因植物，启动能力较强，淹水条件下快速高效启动外源基因在植株根部大量表达，提高植株的耐渍性，或抗虫、抗病等能力；该启动子是只在根部特异表达的组织特异性启动子，对于食用非根部的转基因植物，不存在转基因食品安全问题；为玉米及其他旱生作物的耐渍性遗传改良提供了新的根部特异表达、淹水诱导型的启动子资源，可进一步阐明玉米耐渍性形成的分子机制，具有十分重要的理论价值和实践意义。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/113, C12N15/82
【公开号】CN105063045
【申请号】CN201510467506
【发明人】杜何为, 黄敏
【申请人】长江大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月3日