用SIRPα-Fc融合蛋白处理CD47+疾病细胞的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及治疗性的Fc融合蛋白，其特别用于治疗具有CD47+疾病细胞的对象。 所述融合蛋白基于人SIRPa的胞外区域中的结构域，并且融合了增强该融合蛋白的抗癌 效果的Fc区。
【背景技术】
[0002] 信号调节蛋白a (SIRPa)是属于免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，并且其是CD47 的受体。Ullrich等在US 6541615中描述了人类SIRPa的克隆与表达。Sarfati等在 W01999/040940 中以及 Van den Berg 等在 W000/66159 中暗示了 SIRPa 和 CD47 参与了癌 症及其他疾病的病原学，并且Van den Berg等还提出了 SIRPa抑制剂的治疗应用。最近， Jaiswal等在W02009/091601中提出了 CD47抗体在治疗血癌中的应用。SIRPa和CD47之 间的相互作用在调节巨噬细胞对白血病细胞和白血病干细胞（LSC)的吞噬作用中起到十 分重要的作用。已经示出了阻断抗⑶47抗体能够促进巨噬细胞对LSC的吞噬作用。此外， 在TO 2010/130053中，Wang等提出了基于SIRPa融合蛋白的癌症治疗。对于治疗免疫功 能紊乱，Smith等在US2008/0131431中提出了使用基于CD47的Fc融合蛋白。Raymond等 在TO2010/070047中也教导了治疗炎症和免疫功能紊乱。
[0003] 提供通过SIRP a /⑶47轴抑制信号转导的制剂以用于治疗癌症和其他疾病是有 用的。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了作为Fc融合蛋白的SIRPa，其中选择了所述融合蛋白中的成分以 使得对CD47/SIRP a轴实现最佳抑制。本发明的发明人已经发现，人SIRPa胞外区内的特 定的单一结构域对CD47的结合亲和性大于人SIRPa的完整的胞外区。此外，本发明证明 了当恒定（Fc)区具有效应子功能时，SIRPa Fc融合蛋白在体内的效力令人惊奇地大幅度 提高，尽管对CD47/SIRP a轴的抑制应该不需要这样的活性，并且尽管体外实验表明无效 应子的Fc区应该是优选的。
[0005] 本发明的SIRPaFc融合蛋白还显示了可忽略的CD47激动作用（agonism)，这允许 它们在体内作为SIRPa介导的信号转导的专一性抑制剂。作为进一步的特征，所述融合蛋 白显示了可忽略的红细胞（red blood cell)结合作用。这与该轴的其他抑制剂形成鲜明 对比，例如⑶47抗体，其与红细胞强结合，在一些情况下引起血细胞凝集。通过使用本发明 的融合蛋白，不需要为了 "沉积（sink) "效应来计算剂量，在"沉积"效应中，所施用的药物 以RBC结合的形式变得被螯合并且失活，或者不需要为了由RBC相互作用引起的任何不利 事件来计算剂量。
[0006] 在本发明的一个方面，提供了 SIRPaFc融合蛋白，其用于抑制SIRPa介导的细 胞-结合CD47的刺激作用，该融合蛋白包含：SIRPa蛋白成分，以及与其融合的抗体恒定 区（Fc)成分，其中所述SIRPa蛋白成分由人SIRPa的V结构域构成或包含人SIRPa的 V结构域，并且Fc成分为具有效应子功能的IgG恒定区。在一些实施方案中，Fc选自IgGl 抗体或IgG4抗体的恒定区。
[0007] 在一个相关方面，提供了一种多核苷酸，其编码作为单链多肽的SIRP a Fc融合蛋 白的可分泌形式。在另一个相关方面，提供了用于生产SIRP a Fc融合蛋白的细胞宿主，该 宿主具有被引入并可在其中表达的多核苷酸。以及，在另一个实施方案中，提供了用于获得 SIRP a Fc融合蛋白的方法，包括培养所述宿主或使所述宿主生长，以及回收作为二聚体蛋 白的SIRP a Fc融合蛋白。在一些实施方案中，所述宿主为来自任意物种的能使所表达的蛋 白糖基化的真核宿主。
[0008] 在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其用于治疗具有CD47+疾病细胞 的对象，所述组合物包括可药用的载体和能够有效地抑制CD47+疾病细胞的生长或增殖的 量的SIRP a Fc融合蛋白。
[0009] 在另一个方面，本发明提供了用于治疗具有CD47+疾病细胞的对象的方法，该方 法包括向该对象施用能够有效地抑制所述疾病细胞的生长和/或增殖的量的SIRP a Fc融 合蛋白。在一个相关方面，本发明提供了 SIRP a Fc蛋白在治疗其中存在CD47+疾病细胞的 癌症或任意其他疾病中的应用。本发明还提供了 SIRPaFc蛋白在制备用于治疗其中存在 CD47+疾病细胞的癌症或任意其他疾病的药物中的应用。相似地，本发明提供了一种用于处 理⑶47+疾病细胞的药物组合物，包含SIRP a -Fc蛋白和可药用的载体。在一些实施方案 中，疾病细胞为⑶47+癌细胞，特别包括⑶47+白血病细胞，如AML。
【附图说明】
[0010] 现在将结合附图更加详细地描述本发明的这些和其他方面，其中：
[0011] 图1利用直接结合检验（图1A)和间接竞争检验（图1B)比较了被标示为TTI-602 和TTI-616的SIRPa融合蛋白与人⑶47的结合。更具体而言，比较了具有单一 N端SIRPa V 结构域的311^€^〇〇'1'1-616)的结合作用和由所有三个（￥-(：-〇细胞外311^€[结构域构 成的融合蛋白（TTI-602)的结合作用。A)直接结合检验。将CD47+人Jurkat T细胞与滴 定的量的TTI-602或TTI-616孵育，并利用多克隆抗IgG抗体通过流式细胞仪分析结合。B) 竞争性抑制检验。在滴定的量的冷的竞争物TTI-602或TTI-616的存在下，将Jurkat细胞 与生物素化的SIRPa Fc(TTI_601)孵育。通过流式细胞仪测定结合，并将结果转化为百分 比抑制率，将0%定义为不存在竞争物时的结合。
[0012] 图2示出了三种不同SIRPa融合蛋白的结合谱（Kd)。所示出的是非常相似的结 合谱，其提供了几乎相同的亲和性结合（Kd)值（2.3-2. 4nM)。这是预测的，因为所有三种 蛋白含有相同的SIRPa区，并且预计Fc区不会影响配体结合。更具体而言，将CD47+人 Jurkat T细胞与滴定的量的融合蛋白孵育，并利用多克隆抗IgG抗体通过流式细胞仪分 析结合。然后标准化几何平均数，并且使用非线性回归使数据拟合单位点结合模型，通过 Prism(Graphpad)生成结合曲线和Kd值。
[0013] 图3(也参见图6)示出了 TTI-621和TTI-622表现出相似的促吞噬 (pro-phagocytosis)活性，而TTI-616明显较弱（在10nM剂量时特别明显）。这表明野 生型IgG4或IgGIFc区是SIRP a Fc引发的通过巨噬细胞的肿瘤细胞杀伤作用最大化所需 的。更具体而言，通过在单核细胞集落刺激因子的存在下，培养人外周血CD14+单核细胞 至少一周来产生巨噬细胞，然后用干扰素-y (过夜）和LPS(lh)活化。用CFSE标记OCI/ AML-2细胞，并与SIRP a Fc融合蛋白以指定浓度孵育30分钟，或与ImM对照Fc蛋白（突变 hIgG4Fc(TTI-401)或 hIgGlFc(TTI-402))孵育 30 分钟，或是不进行处理（UT)。然后 AML-2 细胞和巨噬细胞共孵育2小时，巨噬细胞用麦胚凝集素AlexaFluor?555缀合物染色，并 用共聚焦显微镜分析。将吞噬指数定义为每100个巨噬细胞所吞噬的AML细胞数，每个样 品对至少200个巨噬细胞计数。具有突变的hIgG4Fc区的融合蛋白用白色棒表示，野生型 hIgG4用灰色棒表示，野生型IgGl用黑色棒表示。**p〈0. 05，*p〈0. 01对同种型对照（单因 素 AN0VA 以及 Dunnett' s post-检验）。
[0014] 图4示出了具有IgGIFc区的TTI-621融合蛋白是唯一能够在移植处（注射 的股骨）介导抗白血病效应的蛋白。在未注射的骨髓中，有明显的Fc依赖效应，其中 TTI-621 (完全Fc活性）>TTI-622 (低Fc活性）>TTI-616 (无Fc活性）。用源于137C g-辐 照器的275cGy以亚致死量照射N0D/ShiLtJ-Prkdcseld(N0D. SCID)小鼠（8-12周龄），并且 在经股骨内注射从人白血病患者收集的AML细胞之前用抗CD122抗体处理（以消耗NK细 胞）。移植后三周开始，用SIRPaFc融合蛋白处理小鼠（8mg/kg IP每周三次），或用相等 剂量的对照Fc蛋白TTI-401(突变的人IgG4)或TTI-402(人IgGl)处理。处理四周之后， 杀死小鼠，并用流式细胞仪分析注射的股骨中的、未注射的骨髓中的、和脾中的人白血病细 胞，染色以观察人⑶45和人⑶33标记物的表达。以在各腔室中的人⑶45+⑶33+细胞的百 分比来表不AML移入。
[0015] 图5:将CD47+人Jurkat T细胞与SIRP a Fc融合蛋白或对照Fc (3mM)共孵育过 夜、或不处理（UT)过夜，然后对Annexin-V染色并用流式细胞仪分析。使用ImM的促凋亡 试剂星形孢菌素（Staur)作为阳性对照。含有TTI-602的样品用阻断⑶47的抗体B6H12 预处理。
[0016] 图6示出了使用图3中所述的方法得到的结果，但是数据集更详细。
[0017] 图7A)人红细胞用滴定量的抗⑶47抗体B6H12或TTI-616染色并用流式细胞仪 分析。B)人红细胞用一组抗CD47单克隆抗体（2D3、B6H12、BRIC126和CC2C6)或SIRP a Fc 融合蛋白TTI-622染色，并用流式细胞仪分析。每种试剂以之前的优化实验中确定的饱和 浓度使用。TTI-401用作对照Fc。所示数据采集自六个提供者。C)AML-2肿瘤细胞用⑶47 抗体或TTI-622染色，并用流式细胞仪分析。对每种试剂的单一高剂量（660nM)示出数据。
[0018] 发明详述
[0019] 本发明涉及人SIRP a蛋白，其为直接或间接与抗体恒定区或Fc区融合的形式。除 非另有说明，本发明所使用的术语"人SIRPa "是指野生型、内源的成熟形式的人SIRPa。 在人类中，发现SIRPa蛋白主要有两种形式。一种形式（变体1或VI型）的氨基酸序列 作为NCBI RefSeq NP_542970. 1列出（残基27-504构成成熟型）。另一种形式（变体2 或V2型）有13个氨基酸不同并且氨基酸序列在GenBank中作为CAA71403. 1列出（残基 30-504构成成熟型）。这两种形式的SIRPa构成了存在于人类中的大约80%的各种类型 的SIRPa，并且上述这两种形式均被本发明的术语"人SIRPa "涵盖。本发明的术语"人 SIRPa "还包括SIRPa的少数形式，其是人类内源性的、并且具有相同的通过与⑶47结合 而通过⑶47引发信号转导的特性。本发明更具体地涉及变体2型或V2。
[0020] 本发明的SIRPaFc融合蛋白包括位于人SIRPa胞外区域中的三个所谓的免疫 球蛋白（Ig)结构域之一。更具体而言，本发明的SIRPaFc蛋白包括人SIRPa的残基 32-137(106-mer)，根据目前的命名法，其构成并定义了 V2型的IgV结构域。该SIRPa序 列如下所示，在本文中称为SEQ ID No. 1。
[0021] EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRE NMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGA[SEQ ID No. 1]
[0022] 在一个优选的实施方案中，SIRPa Fc融合蛋白引入了如SEQ ID No. 1所述的IgV 结构域，除此以外还引入了该SIRPa序列中的相邻的侧翼残基。该优选形式的IgV结构域 由V2型人SIRPa的残基31-148表示，其为具有如下所示的SEQ ID No. 22的118-mer :
[0023] EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKR ENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS[SEQ ID No. 22]
[0024] 令人惊奇的是，发现在CD47结合亲和性方面，相对于SIRPa的整个胞外结构域的 CD47结合亲和性而言，V2型人SIRPa的活性更高。该结合亲和性比整个胞外结构域的结 合亲和性高至少2倍。在一些实施方案中，V2结构域的亲和性比整个胞外结构域高至少3 倍、4倍、5倍或更高。在本文实施例1记载的直接结合检验中，引入该SIRPa结构域的融合 蛋白的结合亲和性比引入整个SIRPa胞外结构域的融合蛋白的结合亲和性高大约10倍。 类似地，在本文实施例1记载的间接竞争检验中，V2/IgV单一结构域融合蛋白提供了比引 入SIRPa的整个胞外结构域的融合蛋白更高的CD47结合亲和性。因此，基于该优选的V 结构域的SIRPaFc融合蛋白在抑制通过与SIRPa结合而促进的CD47信号转导中有潜力 具有更尚的有效性。
[0025] 本发明的SIRP a融合蛋白还引入了具有效应子功能的Fc区。对效应子功能的偏 好是完全令人惊讶地，并且用关于CD47/SIRPa轴的现有信息很难解释。可以预料的是，无 效应子Fc区的活性足以抑制该轴，并且整合效应子功能不会获得更多的效果。然而，本文 特别是实施例5所示的数据清楚地示出，在融合蛋白的体内抗白血病活性方面，效应子活 性Fc是有利的。根据实施例4所示的结果，这是特别令人惊奇的，在实施例4中，融合蛋白 的体外吞噬活性对于融合蛋白是基于效应子活性的Fc成分还是基于无效应子的Fc成分没 有显示出特别的偏好。
[0026] 因此，在本发明的SIRP a Fc融合蛋白中，合适的Fc成分是具有效应子功能的那 些。"具有效应子功能"的Fc成分是具有至少某些效应子功能的Fc成分，例如至少对抗体 依赖的细胞毒性有一些贡献或锚定补体的一些能力。此外，该Fc至少会结合至Fc受体。 这些特性可以通过针对该目的而建立的检验而体现。功能性检验包括检测靶细胞裂解的标 准铬释放试验。通过这种确定方式，野生型IgGl或IgG4的Fc区具有效应子功能，而突变 为消除了效应子功能（例如通过引入一系列包括