Pr 〇233、Val234、Ala235的改变以及删除 Gly236(EU))的人IgG4的Fc区被认为不具有效应子功能。在一个优选的实施方案中，Fc 基于IgGl同种型的人抗体。这些抗体的Fc区是本领域技术人员容易确认的。在一些实施 方案中，Fc区包括下部的铰链-CH2-CH3结构域。
[0027] 在一个具体的实施方案中，Fc区基于在UniProtKB/Swiss-Prot中作为P01857列 出的人IgGl的氨基酸序列，残基104-330,并且具有如下所示的氨基酸序列，本文中记为 SEQ ID No. 2 ：
[0028] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK*[SEQ ID No. 2]
[0029] 因此，在一些实施方案中，Fc区具有IgGl恒定区的野生型序列或共有序列。在可 选的实施方案中，融合蛋白中引入的Fc区来源于具有典型效应子活性恒定区的任意IgGl 抗体。这样的Fc区的序列可以对应于例如如下任意IgGl序列（均引自GenBank)的Fc区， 例如：BAG65283 (残基 242-473)、BAC04226. 1 (残基 247-478)、BAC05014. 1 (残基 240-471)、 CAC20454. 1 (残基 99-320)、BAC05016. 1 (残基 238-469)、BAC85350. 1 (残基 243-474)、 BAC85529. 1 (残基 244-475)和 BAC85429. 1 (残基 238-469)。
[0030] 在其他实施方案中，Fc区具有野生型人IgG4恒定区的序列。在可选的实施方案 中，融合蛋白中引入的Fc区来源于具有有效应子活性的恒定区的任意IgG4抗体，所述效应 子活性存在但天然地显著弱于IgGIFc区。这样的Fc区的序列可以对应于例如如下任意 IgG4 序列的 Fc 区：来自 UniProtKB/Swiss-Prot 的 P01861 (残基 99-327)和来自 GenBank 的 CAC20457. 1 (残基 99-327)。
[0031] 在一个具体的实施方案中，Fc区基于UniProtKB/Swiss-Prot中作为P01861列出 的人IgG4的氨基酸序列，残基99-327,并且具有如下所示的氨基酸序列并且记为SEQ ID No. 23 ：
[0032] ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGK[SEQ ID No. 23]
[0033] 在一些实施方案中，Fc区引入一个或多个改变，通常不多于约5个这样的改变，包 括影响某些Fc特性的氨基酸置换。在一个具体并优选的实施方案中，Fc区在第228位（EU 编号方式）引入改变，其中该位的丝氨酸被脯氨酸置换（S 22SP)，由此稳定Fc二聚体内的二 硫键。Fc区内的其他改变可以包括改变糖基化的置换，如用甘氨酸或丙氨酸置换Asn 297;半 衰期增强的改变，如US62777375中教导的T252L、T253S和T 256F ;以及许多其他的改变。特别 有用的是在保持构象不变（例如保持Fc受体结合性）的同时能增强Fc特性的那些改变。
[0034] 在一个具体的实施方案中，在Fc成分为IgG4Fc的情况中，Fc至少引入了 S22SP突 变，并且具有如下所示的氨基酸序列并且记为SEQ ID No. 24:
[0035] ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGK[SEQ ID No. 24]
[0036] 因此，本发明提供了有利于抑制人SIRP a与人CD47结合的融合蛋白，从而抑制或 减少了通过SIRP a -结合的⑶47介导的信号传送，该融合蛋白包含人SIRP a成分，以及与 其融合的Fc成分，其中SIRPa成分包含人SIRPaV2的单一 IgV结构域或由人SIRPaV2 的单一 IgV结构域构成，并且Fc成分为具有效应子功能的人IgG恒定区。
[0037] 在一个实施方案中，融合蛋白包含SIRP a成分，该SIRP a成分至少由V2型的野 生型人SIRPa的残基32-137构成，即SEQ ID No.l。在一个优选的实施方案中，SIRPa 成分由V2型的人SIRP a的残基31-148构成，即SEQ ID No. 22。在另一个实施方案中，Fc 成分是记为P01857的人IgGl的Fc成分，在一个具体的实施方案中，具有引入其下部的铰 链-CH2-CH3区的氨基酸序列，即SEQ ID No. 2。
[0038] 因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供了作为表达的单链多肽和作为分泌 的二聚体融合体这两种形式的SIRP a Fc融合蛋白，其中该融合蛋白引入了具有SEQ ID No. 1 (并且优选SEQ ID No. 22)的SIRP a成分，以及与其融合的具有效应子功能且具有SEQ ID No. 2的Fc区。当所述SIRP a成分为SEQ ID No. 1时，该融合蛋白包含如下所示的SEQ ID No. 3 ：
[0039] EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKR ENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*[SEQ ID No. 3]
[0040] 当所述SIRP a成分为SEQ ID No. 22时，该融合蛋白包含如下所示的SEQ ID No. 25 ：
[0041] EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKR ENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[SEQ ID No. 25]
[0042] 在可选的实施方案中，所述融合蛋白的Fc成分基于IgG4,优选基于引入了 S22SP突 变的IgG4。在融合蛋白引入了 SEQ ID No. 22所示的优选的SIRPa IgV结构域的情况中，所 得的基于IgG4的SIRP a -Fc蛋白具有如下所示的SEQ ID No. 26 :
[0043] EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKR ENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK[SEQ ID No. 26]
[0044] 在本发明的优选实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID No. 22所示的序列作为该融合 蛋白的SIRP a IgV结构域。优选的SIRP a Fc为SEQ ID No. 25。
[0045] 在SIRPa Fc融合蛋白中，SIRPa成分和Fc成分直接或间接融合以提供单链多肽， 其最终以二聚体形式产生，其中所述单链多肽通过在Fc区内形成的链内二硫键连接。融合 区的性质不是关键的。融合可以是两个成分之间直接融合，其中SIRP成分构成融合蛋白的 N末端并且Fc成分构成C末端。或者，融合可以通过连接物间接形成，所述连接物由一个 或多个氨基酸，理想的是遗传编码的氨基酸构成，如由2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、 9个或10个氨基酸构成，或者由介于5个和100个之间的氨基酸（例如介于5个和50个 之间、介于5个和30个之间、或介于5个和20个之间的氨基酸）中的任意数目的氨基酸构 成。连接物可包括由构建有限制酶位点的DNA编码的多肽，所述限制酶位点如BamHI、Clal、 EcoRI、Hindlll、PstI、Sail 和 Xhol 位点等。
[0046] 通常并且理想的是，连接物氨基酸提供一定的柔性，从而使Fc和SIRP成分能够采 取其活性构象。允许这样的柔性的残基通常为Gly、Asn和Ser，由此实际上连接物中的这 些残基（特别是Gly和Ser)的任意组合都可能提供期望的连接效果。在一个例子中，这样 的连接物基于所谓的G 4S序列（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)，其可作为（G4S)n重复，其中n为1、 2、3或更大；或基于（Gly)n、（Ser)n、（Ser-Gly)n或（Gly-Ser)n等。在另一个实施方案中， 连接物为GTELSVRAKPS (SEQ ID No. 21)。该序列以C端侧翼连接IgV结构域而构成SIRP a 序列（应当理解为该侧翼序列可以被认为是连接物，或者当与上文所述的IgV最小序列连 接时可以被认为是IgV结构域的不同形式）。仅仅融合区域或连接物使得所述成分采取其 活性构象是必需的，这可以通过用于本领域的任意形式的连接物来实现。
[0047] SIRP a Fc融合蛋白有利于抑制SIRP a和⑶47之间的相互作用，从而阻断通过该 轴的信号传递。已知SIRP a通过⑶47对巨噬细胞的刺激作用能够通过使肌球蛋白-II和 收缩性细胞骨架活性失活来抑制巨噬细胞介导的吞噬作用，所述肌球蛋白-II和收缩性细 胞骨架活性参与将目标拉入巨噬细胞。因此，该级联反应的激活对于CD47+疾病细胞的存 活是重要的，并且阻断该通路能使巨噬细胞消灭CD47+疾病细胞群。
[0048] 术语"⑶47+"用于表示由本发明的多肽结合的靶细胞的表型。⑶47+的细胞可使 用CD47抗体作为亲和配体通过流式细胞仪来鉴定。用于该目的的带有合适的标记的CD47 抗体是市购可得的（例如克隆B6H12可购自Santa Cruz Biotechnology公司）。用于检 验CD47表型的细胞可包括标准肿瘤活组织检查样品，其包括（特别是）从被怀疑具有内源 性CD47+癌细胞的对象中获得的血液样品。特别关注的作为本发明的融合蛋白治疗靶标的 ⑶47疾病细胞为"过表达"⑶47的那些。这些⑶47+细胞通常为疾病细胞，并且在其表面 具有密度超过指定细胞类型所具有的正常CD47密度的CD47。不同细胞类型的CD47过表达 程度不同，但在本文中是指，（例如）通过本文所示例的流式细胞仪或通过免疫染色或通过 基因表达分析等被确定为高于具有CD47表型的相应细胞的对于该细胞类型而言正常可检 测水平的任意CD47水平。
[0049] 因此，对于治疗应用，本发明提供了一种药物组合物，包括可药用的载体和治疗有 效量的本发明所述的SIRP a Fc融合蛋白。如本文所用，"可药用的载体"是指在蛋白质/抗 体制剂领域中任意和所有的生理学相容且有益的溶剂、分散介质、包覆层、抗菌剂和抗真菌 剂、等渗剂和吸收延迟剂等。可药用的载体的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、甘 油、乙醇等中的一者或多者、及其它们的组合。在许多情况中，在组合物中优选地包括等渗 剂，例如：糖类、多元醇（如甘露醇、山梨醇）或氯化钠。可药用的载体还可包括少量的辅 助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加药学试剂的保质期或有效性。在一些 实施方案中，采用治疗抗体制剂领域的实践标准来配制SIRP a Fc融合蛋白。适合静脉给药 (如注射或输注）的溶液是特别有用的。
[0050] 可通过将所需量的活性化合物混入适当的溶剂中，根据需要加入上述成分中的一 种或组合，然后灭菌微孔过滤，从而制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物混入含有基 本分散介质的无菌载体，加入所需的选自上文所列举的例子中的其他成分，从而制备分散 体。在用于制备的无菌粉末为真空干燥和冷冻干燥（冻干）的情况中，从预先灭菌过滤的 溶液中产生活性成分以及