一种促进重组极端耐热α-淀粉酶可溶性表达的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种促进重组极端耐热a-淀 粉酶可溶性表达的方法。
【背景技术】
[0002] a-淀粉酶又称为淀粉1，4_糊精酶，是一种内切酶，能随机地切断淀粉、糖原、寡 聚或多聚糖分子内的a-1，4-糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用 最为广泛的酶制剂之一。目前，a-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤 酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业和医药行业，是一种重要工业用酶。
[0003] 耐高温a-淀粉酶是工业上最常用的酶制剂之一。工业上现今常用的耐热a-淀 粉酶来源于Bacillus licheniformis (BLA)，其最适作用温度为90°C而且需要与Ca2+作用 来维持其热稳定性。但该酶仍存在不足之处：首先，BLA的热稳定性仍不够高；其次，BLA的 最适pH偏高为7. 0-8. 0 ;再次，BLA需要钙离子来维持其热稳定性。
[0004] 重组极端耐热a-淀粉酶PFA来源于极端嗜热古菌P.furiosus，具有十分优秀的 酶学性质与酶学特点，在多项关键指标方面远优于目前市场上的传统的耐热a-淀粉酶。 例如其最适温度接近1〇〇°C，并具有极其优良的耐热性，在100°C数小时不丧失活性（一般 耐热淀粉酶如BLA在接近100°C时的半衰期仅有数分钟）。同时，极端耐热a-淀粉酶PFA 的活性与耐热性均不需要另外添加钙离子，且其最适PH为酸性，可以大大便利工业应用过 程中的后续环节。另外，该酶的淀粉水解产物主要成分为麦芽寡糖，以G2-G7为主，单糖（葡 萄糖）含量低于2%。这些优点与特点提示重组PFA有望在包括淀粉高温液化、超高纯度高 麦芽糖浆的生产以及纺织印染等等多种工业化生产过程中发挥卓越的作用，具有极高的潜 在工业应用价值。
[0005]P.furiosus是从海底火山温泉中的分离得到的绝对厌氧菌，最适生长温度 10CTC[HaruyukiAtomi等，CurrentOpinioninBiotechnology，2011，5(22) :618_626]， 培养相对较为复杂，难以实现大规模工业培养，PFA的较大量制备只能通过外源重组表达方 能够实现。迄今已有多家国内外实验室对PFA的蛋白结构、酶学性质以及重组表达等方面 进行了研究，至今尚未有适合该酶大规模制备方法的报道。国外的研究结果与本发明人对 PFA的研究结果发现当重组PFA在E.coli中大量表达时，表达的重组PFA主要是不溶性的 包涵体，这为该酶的大规模纯化与制备等下游工程带来了极大的不便。
[0006] 本发明人前期对重组极端耐热alpha-淀粉酶PFA进行了较为深入的研究。首 先研究了重组PFA在大肠杆菌中进行大量表达，发现重组PFA主要以不溶性的包涵体形 式表达。之后对PFA包涵体纯化复性的方法进行了研究，建立了碱变性-加热-稀释复 性的纯化方法，获得了具有较高生物活性的重组PFA[LisaWang等，JIndMicrobiol Biotechnol. 2007. (34) : 187 - 192 ;张毅等，中国发明专利：一种嗜热a-淀粉酶的制备纯 化方法，专利号：ZL20061 0025974.0]。在进一步对纯化酶的稳定性研究过程中发现，一定 浓度的去垢剂对重组PFA的酶活性没有影响，由此建立了采用去垢剂对重组PFA包涵体进 行溶解复性与纯化的方法[张毅等，中国发明专利：重组极端耐热a-淀粉酶的复性与纯化 方法，专利号：ZL200810039429. 6]。
[0007] 尽管如此，对于重组酶而言，可溶性表达更具应用与生产的便利性及生产成本的 可控性。由于重组极端耐热alpha-淀粉酶PFA自身的特性，现有技术中，对该酶实现可溶 性的重组高表达十分困难。
[0008] 因此，本领域还需要进一步研究适用于重组表达极端耐热alpha-淀粉酶PFA的表 达系统以及表达方法。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种促进重组极端耐热a_淀粉酶可溶性表达的方法。
[0010] 在本发明的第一方面，提供一种重组表达极端耐热a-淀粉酶的方法，所述方法 包括：将极端耐热a-淀粉酶的编码基因与分子伴侣蛋白Prefoldin的编码基因共同表达， 获得可溶性的极端耐热a-淀粉酶。
[0011] 在一个优选例中，所述的共同表达的表达宿主包括：原核细胞，真核细胞。较佳地， 所述的原核细胞包括但不限于大肠杆菌细胞；所述的真核细胞包括但不限于酵母细胞。优 选地，所述的表达宿主是大肠杆菌细胞。
[0012] 在另一优选例中，所述的分子伴侣蛋白Prefoldin来源于极端嗜热古菌 P.furiosus〇
[0013] 在另一优选例中，所述的极端耐热a_淀粉酶来源于极端嗜热古菌P.furiosus。
[0014] 在另一优选例中，所述的极端耐热a-淀粉酶的编码基因与分子伴侣蛋白 Prefoldin的编码基因在大肠杆菌细胞中共同表达。
[0015] 在另一优选例中，所述的共同表达的方法包括：
[0016](1)提供表达载体，所述的表达载体含有极端耐热a-淀粉酶的表达盒和分子伴 侣蛋白Prefoldin的表达盒；
[0017] (2)将（1)的表达载体转化大肠杆菌细胞，培养转化有所述表达载体的重组大肠 杆菌细胞，获得可溶性的极端耐热a-淀粉酶。
[0018] 在另一优选例中，所述的含有极端耐热a-淀粉酶的表达盒和分子伴侣蛋白 Prefoldin的表达盒分别位于不同的表达载体中，或位于同一表达载体中。
[0019] 在另一优选例中，所述的表达载体包括（但不限于）：pT7473,pACYC或p⑶F。
[0020] 在另一优选例中，所述的极端耐热a-淀粉酶是极端耐热a-淀粉酶PFA。
[0021] 在本发明的另一方面，提供分子伴侣蛋白Prefoldin的用途，用于促进重组极端 耐热a-淀粉酶可溶性表达。
[0022] 在一个优选例中，所述的分子伴侣蛋白Prefoldin通过与极端耐热a-淀粉酶共 同表达，促进极端耐热a-淀粉酶的可溶性表达。
[0023] 在本发明的另一方面，提供重组的宿主细胞，所述的宿主细胞中含有极端耐热 a-淀粉酶的表达盒和分子伴侣蛋白Prefoldin的表达盒。
[0024] 在一个优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞。
[0025] 在本发明的另一方面，提供一种重组表达极端耐热a-淀粉酶的试剂盒，所述试 剂盒中包括：
[0026] 表达载体，所述的表达载体含有极端耐热a_淀粉酶的表达盒和分子伴侣蛋白 Prefoldin的表达盒。
[0027] 在一个优选例中，所述的含有极端耐热a-淀粉酶的表达盒和分子伴侣蛋白 Prefoldin的表达盒分别位于不同的表达载体中，或位于同一表达载体中。
[0028] 在另一优选例中，所述的表达载体包括（但不限于）：pT7473,pACYC或p⑶F。
[0029] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：大肠杆菌细胞。
[0030] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0031] 图1、来源于P.furiosus的分子伴侣蛋白Prefoldin和Hsp60对重组极端耐热淀 粉酶PFA可溶性表达的影响。
[0032] A为各菌株破碎后离心上清液中PFA的比活，BL21 (DE3)为空宿主菌，PFA 为重组PFA表达菌，PFA+pACYC为同时转化pACYC质粒与PFA表达质粒的菌株， PFA+pACYC-Prefoldin为同时转化pACYC-Prefoldin质粒与PFA表达质粒的菌株， PFA+pACYC-Hsp60为同时转化pACYC-Hsp60质粒与PFA表达质粒的菌株。
[0033]B为各菌株破碎后的离心上清与沉淀样品的SDS-PAGE电泳图，各泳道中样品 如下：M为marker;1-2为BL21(DE3)菌体破碎后上清与沉淀，3-4为重组PFA表达菌体 破碎上清与沉淀，5-6为同时转化pACYC质粒与PFA表达质粒的菌体破碎上清与沉淀 (PFA+pACYC)，7-8为同时转化pACYC-Prefoldin质粒与PFA表达质粒的菌体破碎上清与沉 淀（PFA+pACYC-Prefo