34):187-192。
[0061]pACYC-Prefoldin载体与pQ)F_Prefoldin载体构建：抽提pPFD质粒（pPFD质粒 构建详见HuiChen等，BiotechnolLett. 2010. (32) :429-434)，用Ncol、Sail两种限制型 内切酶双酶切得到编码Prefoldin的基因表达片段，经琼脂糖凝胶电泳回收纯化待用。将 pACYCDuet-1(Novagen公司）、pCDFDuet_l质粒（Novagen公司）分别用NcoI、SalI双酶切 后琼脂糖凝胶电泳回收。双酶切后的Prefoldin编码基因分别与双酶切后的pACYCDuet-1、 pCDFDuet-1质粒混合，加入T4DNA连接酶，16°C反应16小时，分别获得pACYC-Prefoldin载体与p〇)F-Prefoldin载体。
[0062] pACYC-PFA的构建：将两端带有PshBI/XhoI酶的PFA克隆入pACYC质粒相应位点 中。
[0063] p⑶F-PFA的构建：将两端带有PshBI/XhoI酶的PFA克隆入p⑶F质粒相应位点中。
[0064] pACYC-Prefoldin-PFA的构建：如前获得pACYC-PFA，再将两端带有Ncol/Sall酶 的Prefoldin克隆入该质粒相应位点中，获得pACYC-Prefoldin-PFA。
[0065] pCDF-Prefoldin-PFA的构建：如前获得pCDF-PFA，再将两端带有Ncol/Sall酶的 Prefoldin克隆入该质粒相应位点中，获得pO)F-Prefoldin-PFA。
[0066] pACYC-Hsp60载体构建：抽提含有HSP60编码基因的pET21-PfCPN质粒 (pET21_PfCPN质粒构建详见Hua-youChen等，JournalofBasicMicrobiology2007. (47) : 132-137)，用NdeI与XholI双酶切，HSP60编码基因DNA片段经琼脂糖凝胶电泳回 收纯化待用。PACY⑶uet-1质粒经NdeI与XholI双酶切后与回收的HSP60编码基因DNA 片段进行连接反应，获得pACYC-Hsp60载体。
[0067] 将上述表达载体单独或以不同的组合转化EcoliBL21(DE3)菌株，分别获得以下 重组菌株：
[0068] 携带pT7473-PFA表达载体的EcoliBL21 (DE3)表达菌株；
[0069] 携带pACYC-Prefoldin载体的EcoliBL21 (DE3)表达菌株；
[0070] 携带pCDF-Prefoldin载体的EcoliBL21 (DE3)表达菌株；
[0071] 携带pT7473-PFA与pACYC-Prefoldin两种载体的EcoliBL21 (DE3)表达菌株；
[0072] 携带pT7473-PFA与pCDF-Prefoldin两种载体的EcoliBL21 (DE3)表达菌株。
[0073] 携带pT7473-PFA与pACYC-HSP60 两种载体的EcoliBL21 (DE3)表达菌株。
[0074] 携带pACYC-Prefoldin-PFA载体的EcoliBL21(DE3)表达菌株。
[0075] 携带pCDF-Prefoldin-PFA载体的EcoliBL21 (DE3)表达菌株。
[0076] 携带pCDF-PFA的EcoliBL21 (DE3)表达菌株。
[0077] 携带pACYC-PFA的EcoliBL21 (DE3)表达菌株。
[0078] 主要试剂与溶液
[0079] LB培养基：IOgNaCl，5g酵母粉，IOg蛋白胨溶于1000 ml去离子水中；
[0080] 超声破碎缓冲液：Tris.HCl(pH8. 0) 50mM，EDTA10mM，NaClIOOmM;
[0081 ]DNS试剂：Ig3, 5-二硝基水杨酸溶解于20ml2mol/LNaOH中，加入30g酒石酸钠 钾，稀释至100mL;
[0082] 铜-酒石酸盐_碳酸盐（CTC):将20 % (w/v)的碳酸钠溶液缓慢地加入硫酸铜-酒 石酸溶液中缓慢搅拌至硫酸铜（五水化合物）的终浓度为〇. 1% (w/v)，酒石酸钾钠的终浓 度为0. 2% (w/v)，碳酸钠的终浓度为10% (w/v);
[0083] 10%SDS:将IOgSDS溶于100mL去离子水中配成10%储液，使用时稀释需10倍；
[0084] 0. 8NNaOH；
[0085] Folin-酚试剂：从生工购买，浓度为2N;
[0086] 0? 15% (w/v)脱氧胆酸钠（DOC);
[0087]72% (w/v)三氯酸钠（TCA);
[0088] 试剂A:将CTC、NaOH、SDS与水等量（按照体积）混合；
[0089] 试剂B:将1体积的2NFolin-酚试剂与5体积的去离子水混合。
[0090] 重组菌体的获得
[0091] 首先接种-80°C甘油保存菌种于3ml无菌但含有相应抗性的LB培养基中 37°C250rpm过夜培养。第二天按1 %的接种量接种过夜培养的菌液于200ml含相应抗性的 无菌LB中培养2h，2h后加入IPTG至终浓度为0.ImM诱导4h。4h后于5000rpm离心30min， 弃上清，收集菌体并测菌体湿重。
[0092]以相同的方法收集BL21 (DE3)、含pT7473-PFA重组质粒的BL21 (DE3)、含pACYC 与 PT7473-PFA 重组质粒的BL21 (DE3)、含 pACYC-Prefoldin 与 pT7473-PFA 重组质粒 的BL21 (DE3)、含 pCDF 与 pT7473-PFA 重组质粒的BL21 (DE3)、含 pCDF-Prefoldin 与 PT7473-PFA重组质粒的BL21 (DE3)菌种的菌体。
[0093] 细胞破碎
[0094] 将菌体用超声破碎液按其湿菌体重量以0.lg/ml悬浮，用超声破碎5min，间隔 5min，再破碎5min，所有的操作都在冰浴上进行。所有样品的破碎操作均一致。破碎后于 10,OOOrpm离心30min，收集上清与沉淀，沉淀用相同体积的破碎液重悬并充分摇勾。取相 同体积（15ul)的上清与沉淀SDS-PAGE蛋白质电泳分析。另取样适度稀释后在KKTC测定 淀粉酶活性。其余的样品置于4°C冰箱中保存以进行后续实验。
[0095] 高温淀粉酶活力测定方法（DNS法）
[0096] 将获得的上清液进行定量的稀释，测定上清酶活。
[0097] 将定量稀释的酶液加入到含1% (w/v)淀粉的50mmol/LpH为5. 0的醋酸钠溶液 中至终体积为500ul，100°C反应15min，迅速放入冰水浴中终止反应。加入500ulDNS试剂， 于沸水中煮5分钟，迅速放入冰水中冷却，加入5ml水，摇匀，用紫外-可见光分光光度计测 其在546nm处的吸光度值。以葡萄糖与DNS试剂的反应作标准曲线。定义1个酶活力单位 为1分钟降解淀粉生成Iumol还原性糖的酶量。
[0098] 蛋白含量的测定方法（Folin-酚法）
[0099] 将获得的上清液进行定量的稀释，对上清液蛋白浓度进行测定。
[0100] 往Iml样品中加入0.Iml0. 15% (w/v)脱氢胆酸钠，室温下放置lOmin，加入 0.1ml72% (w/v)的TCA溶液混合均匀，于3000转离心15min，弃上清。往沉淀中加入Iml 去离子水，加入Iml试剂A，混合均勾并在室温下放置lOmin。加入0. 5ml试剂B，立即混合 均匀，30min后用分光光度计测其在750nm处的吸光度值。
[0101] 实施例1、Prefoldin与HSP60对极端耐热淀粉酶PFA可溶性表达的影响
[0102] 本发明人考察了多种来源的分子伴侣蛋白，将它们分别与极端耐热淀粉酶PFA共 同表达时，考察是否有助于重组PFA的可溶性表达。经过筛选，最后将研究范围确定在：来 源于极端嗜热古菌P.furiosus的两种分子伴侣蛋白Prefoldin及Hsp60。
[0103]Prefoldin与Hsp60的编码序列分别被克隆至pACYC质粒中，分别标记为 pACYC-Prefo