碳酸镧分离富集核酸的方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及碳酸镧的用途，具体涉及碳酸镧分离富集核酸的方法及用途。
【背景技术】
[0002] 随着现代生物学技术的不断发展，生物科学的研究成果得到了广泛应用，作为生 物体遗传信息的携带者，核酸（包括DNA和RNA)及其分析在后基因组时代相关的生命分析 化学、临床医学诊断、疾病预防、法医检验等应用中具有重要意义，核酸的纯度是保证这些 分析顺利进行的前提和基础；在实际应用中，核酸往往是从活的生物体或组织样本中提取 而来，多种机体组分如蛋白质、脂类、糖类等的存在会对核酸的分析产生严重干扰，因此从 复杂的样品中获得较高纯度的核酸是进行后续分析操作的前提条件；
[0003] 核酸的分离主要分为粗分离和精分离两个阶段，粗分离是指将核酸与其它非核酸 组分（如蛋白质、脂类、糖类等）分离，精分离是指将粗分离得到的核酸样品根据不同分子 量、电荷或构型进行分离，从而得到分子量在特定范围或特定构型的DNA或RNA片段；
[0004] 核酸粗分离是核酸精分离的基础和前提，现有的核酸粗分离方法主要包括酚抽提 法、玻棒缠绕法、甲酰胺解聚法、柱色谱法和固定相吸附法等等，其中固定相吸附法通过特 定的固定相材料与核酸进行选择性结合，进而将核酸与其它非核酸组分分离，具有操作简 便快速、分离效率高、对核酸结构破坏性小、适于批量操作等优点，现有技术中的固定相材 料主要包括玻璃粉、玻璃珠、磁珠及表面修饰的磁珠等等，而固定相吸附法由于固定相材料 成本高且回收操作复杂而难以广泛应用；
[0005] 核酸的富集包括将核酸从浓度较低的核酸溶液中提取出来，或将核酸从一种溶液 体系中转移至另一种不同的溶液体系中，现有技术中常采用玻棒缠绕法对核酸进行富集， 但此方法仅适用于浓度较高的核酸溶液，对核酸稀溶液中核酸的富集效率较差，而实际生 产或研究的过程中提取出的核酸往往为稀溶液，采用常规方法难以有效富集其中的核酸成 分，因此，亟需开发一种适用于核酸稀溶液中核酸富集的方法。
[0006] 碳酸镧可用于治疗高磷酸盐血症，其原理是碳酸镧可与磷酸盐结合，生成磷酸镧 复合物，从而降低体内血清磷酸盐水平；
[0007]发明人据此推测碳酸镧与核酸基本组成单位中的磷酸基团具有亲和性，可能选择 性结合核酸，从而作为固定相材料对核酸进行分离富集；
[0008] 基于上述推测和现有问题的存在，本发明人对碳酸镧分离富集核酸进行研究，以 便研究出碳酸镧分离富集核酸的方法及用途。
【发明内容】
[0009] 为了克服上述问题，本发明人对碳酸镧与核酸的相互作用进行了锐意研究，结果 发现：在合适的缓冲溶液中，碳酸镧可以凭借其表面所带的正电荷与核酸中带负电荷的磷 酸基团通过静电力结合，生成难溶的碳酸镧-核酸复合物；难溶的碳酸镧-核酸复合物可用 氨羧配合剂进行洗脱，使得核酸脱离碳酸镧的结合，重新溶解到缓冲溶液中，离心除去不溶 的碳酸镧后，即可得到纯度较高的核酸溶液；洗脱后的碳酸镧用少量稀酸进行淋洗后可重 复使用，其与核酸的结合能力不受影响；此外，可将碳酸镧制成粒径更小的纳米颗粒，以增 大其比表面积，提高碳酸镧对核酸的结合能力。
[0010] 本发明的目的在于提供以下方面：
[0011] (1)使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，该方法包括：
[0012] 步骤1)，将碳酸镧固体高速剪切处理，制备成碳酸镧纳米颗粒；
[0013] 步骤2)，将待分离富集的核酸样品溶于缓冲溶液一中，加入步骤1)中所述碳酸镧 纳米颗粒，搅拌〇. 2~2. 5小时，优选0. 3~1. 8小时，最优选0. 3~1. 5小时，离心分离， 得到固相部分一，所述固相部分一为碳酸镧纳米颗粒-核酸复合物；
[0014] 步骤3)，将步骤2)中所述固相部分一用蒸馏水清洗后加入到缓冲溶液二中，搅拌 0. 1~1. 5小时，优选0. 2~I. 0小时，最优选0. 2~0. 5小时，离心分离，得到上清液和固 相部分二，所述上清液为分离富集后的核酸溶液；
[0015] 步骤4)，将步骤3)中所述固相部分二使用稀酸进行淋洗，蒸馏水清洗至中性，离 心分离，得到固相部分三，所述固相部分三为回收的碳酸镧纳米颗粒。
[0016] (2)根据上述（1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤 1)中所述碳酸镧为La2(CO3)3 ?xH20,其中X值为0~8。
[0017] (3)根据上述（1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤 1) 中所述碳酸镧纳米颗粒的粒径为100~500nm。
[0018] (4)根据上述（1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤 2) 中所述核酸包括DNA和RNA。
[0019] (5)根据上述（1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤 2) 中所述缓冲溶液一的pH值为5. 5~9. 0,优选为5. 5~6. 5,最优选为5. 5~6. 0。
[0020] (6)根据上述（1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤 3) 中所述缓冲溶液二为氨羧配合剂或磷酸盐缓缓冲溶液，优选为磷酸钠、磷酸一氢钠、磷酸 二氢钠、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、EDTA或EGTA缓冲溶液，最优选为磷酸二氢钠、磷 酸二氢钾或H)TA缓冲溶液；所述缓冲溶液二的pH值为5. 5~9. 0,优选为7. 0~9. 0,最优 选为8. 0~8. 5。
[0021] (7)根据上述（1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤 4) 中所述稀酸优选使用乙酸、稀盐酸、稀硝酸、稀高氯酸，最优选使用稀盐酸、稀硝酸、稀高 氯酸。
[0022] (8)根据上述（1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步骤 4)中所述稀酸的pH值为0~3,优选为0. 2~2. 5,最优选为0. 3~2. 0。
[0023] (9)根据上述（1)所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法，其特征在于，步 骤2)、步骤3)和步骤4)中所述离心分离的转速为15000~25000r/min，优选为17000~ 23000r/min，最优选为 18000 ~22000r/min。
[0024] (10)碳酸镧在核酸分离富集中的应用，其特征在于，该应用采用如上述权利要求 1至9所述的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法。
[0025] 本发明所具有的有益效果包括：
[0026] (1)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法采用碳酸镧作为固定相材 料，对核酸进行分离富集，碳酸镧制备简便，价格便宜，降低了核酸分离富集的成本；
[0027] (2)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法仅需使用少量温和无毒的 缓冲溶液和有机酸碱，对使用者损害小且对环境友好；
[0028] (3)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法将碳酸镧固体粉末进行高 速剪切处理，制备成粒径更小的纳米颗粒，增加了比表面积，从而提高碳酸镧对核酸的结合 率，提高分离富集效果；
[0029] (4)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法优选采用乙二胺四乙酸 (EDTA)缓冲溶液作为洗脱剂，使核酸脱离碳酸镧的结合并重新溶解核酸，所述EDTA缓冲溶 液为常用的核酸保存液，无需再对分离富集后的核酸进行二次分离，从而简化了操作步骤， 便于应用实施；
[0030] (5)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法将使用过的碳酸镧用少量 稀酸进行淋洗，即可重复使用，回收的碳酸镧对核酸的结合能力不受影响，从而进一步降低 了使用成本；
[0031] (6)本发明提供的使用碳酸镧进行核酸分离富集的方法具有操作简便、快速有效、 成本低等特点，适用于传统方法不适用的核酸的大规模批量分离富集和稀溶液中核酸的分 离富集，有利于实现核酸分离富集的自动化和机械化；
[0032] (7)本发明提供的碳酸镧在核酸分离富集中的应用，开辟了碳酸镧的新用途，为碳 酸镧在其它领域的理论及实际应用研究奠定了基础。
【附图说明】
[0033] 图1示出八水合碳酸镧固体粉末的XRD图谱；
[0034] 图2示出八水合碳酸镧纳米颗粒的XRD的图谱；
[0035] 图3示出八水合碳