调节植物种子发育的基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术工程领域，更具体地，本发明涉及一种调节植物种子发育的 基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 水稻等禾本科植物是人类重要的粮食作物之一，其耕种与食用的历史都相当悠 久。稻米不仅营养价值高（包含了糖类、蛋白质、钙、磷、维生素B群）而且淀粉粒小且纤 维素含量少，使其独具口感好又便于人体消化的优点。为了应对由全球人口的持续增长和 生态环境恶化造成的全球性粮食短缺问题，育种家们致力于改良作物培育稳定高产的新品 种。粒重作为水稻产量的三个主要因素之一（包括：每株有效穗数、每穗粒数和粒重）由 粒长、粒宽和粒厚决定的，人们希望通过分析利用水稻种子大小的调控机理以有效地提高 育种家门培育稳定高产作物的效率。另有充分的证据表明种子的大小与植物生长的许多方 面，例如与小粒种子相比大粒品种在苗期能忍受更大的压力，而小粒品种在给定同样的能 量下能结出更多的种子。尽管研究者认识到种子大小的发育不仅由内在的发育信号所控 制，且经常受到外界环境信号的影响。但是目前对其中的分子机制知之甚少，因此探索决定 植物种子大小和重量的遗传发育和分子机制具有重要意义。
[0003] 近十多年来，研究者们利用图位克隆技术发现了一些与种子大小性状紧密相关的 主效QTL。在水稻中，已经鉴定了GS3、GIF1、GW2、GW5和GW8五个控制谷粒大小的基因： GS3控制谷粒长度和重量，编码GS3转膜蛋白；GW2控制谷粒宽度和重量，编码环指泛素连接 酶E3 ;GIF1控制谷粒充实度，编码细胞壁转化酶；GW5和GW8控制谷粒宽度和重量，编码多 聚泛素结合核蛋白和转录因子。另有DNAMETHYLTRANSFERASEl(METl)和DECREASEINDNA METHYLATI0N1 (DDMl)突变急剧减少DNA甲基化，导致亲本效应影响种子大小。
[0004] 随着是一类重要的small RNAs (sRNAs)分子一microRNAs (miRNAs)在禾本科植物 中的发现，越来越多的证据表明不仅这些编码的蛋白产物的QTL基因可以影响了水稻的产 量性状，miRNAs也被报道直接或间接地参与种子大小的调控。在水稻中过量表达0smiR397 会降低靶基因LAC的蛋白产物从而增大种子大小有效提高了水稻产量。玉米中也报道了与 miR156相近的ZmmiR529调控靶基因TASSELSHEATH4控制分生组织建成影响籽粒发育。
[0005]miR156是一类广泛存在于绿色植物中的高度保守的小RNA。尽管目前尚未有其调 控植物种子大小的证据，但是在多个物种中都已明确报道其靶向的SPL基因家族对花序及 种子发育的调控作用。ShaokuiWang等人发现的控制水稻粒宽及产量的重要数量形状基 因GW8-SPL16为0sSPL16家族成员。另有研究表明对于玉米花序形态建成具有重要作用的 TEOSINTEGLUMEARCHITECTURE(TGAl)基因也隶属SPL家族。尽管这些证据提示miRNAs对 植物种子发育具有重要作用，但相较于编码基因人们对二者的联系仍然知之不多。因此，本 领域有必要进一步研究与种子发育相关的小RNA。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种调节植物种子发育的基因及其应用。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种提高植物产量、增大植物种子、增大植物种子颖壳 或增加植物分蘖数目的方法，所述植物是禾本科植物，所述方法包括：上调植物中miR535 基因或其前体的表达（即：使之过表达）。
[0008] 在一个优选例中，所述的禾本科植物包括（但不限于）：水稻、小麦、玉米、黑麦、高 粱。
[0009] 在另一优选例中，所述的miR535基因的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示；或
[0010] 所述的miR535前体的核苷酸序列如SEQIDNO: 3所示。
[0011] 在另一优选例中，所述上调植物中miR535基因或其前体的表达包括：将表达 miR535基因或其前体的载体转入植物中。
[0012] 在另一优选例中，所述方法包括：利用农杆菌转化法将表达miR535基因或其前体 的载体转入植物中。
[0013] 在另一优选例中，所述方法包括：
[0014] (1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有能够在细胞内形成miR535 前体的序列；
[0015] (2)将植物细胞、组织或器官与步骤⑴中的农杆菌接触，从而使所述能够在细胞 内形成miR535前体的序列转入植物；和
[0016] (3)选择出转入了能够在细胞内形成miR535前体的序列的植物；
[0017] 较佳地，所述的能够在细胞内形成miR535前体的序列的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
[0018] 在另一优选例中，所述的表达载体中，利用强启动子驱动基因的表达。
[0019] 在另一优选例中，所述的增大植物种子包括：增长植物种子粒长和增宽植物种子 粒宽。
[0020] 在本发明的另一方面，提供一种miR535基因或其前体的用途，用于：
[0021] 提高植物产量；
[0022] 增大植物种子；
[0023] 增大植物种子颖壳；
[0024] 增加植物分蘖数目；或
[0025] 剪切植物细胞内的SPL3、SPL11、SPL12、SPL14或SPL16基因，下调这些基因的表 达；
[0026] 其中，所述植物是禾本科植物。
[0027] 在本发明的另一方面，提供一种miR535基因或其前体的用途，用于增加植物种子 外颖壳的细胞数或促进植物花器官发育，所述植物是禾本科植物。
[0028] 在一个优选例中，所述的miR535基因的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示；或
[0029] 所述的miR535前体的核苷酸序列如SEQIDNO: 3所示。
[0030] 在本发明的另一方面，提供一种miR535基因或其前体的用途，用于作为鉴定植物 产量性状、种子性状、颖壳性状或分蘖性状的分子标记。
[0031] 在一个优选例中，若经检测植物组织中miR535基因或其前体表达高于一个特定 值，则相对而言，所述植物的产量增加、植物种子增大、植物种子颖壳增大或植物分蘖数目 增加。其中，除非另外说明，所述的"特定值"是指野生型植物中miR535基因或其前体表达 量的平均值。
[0032] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0033] 图1表示0smiR535与0smiR156的序列比对。
[0034] 图2表示同源小RNA:miR156、miR157、miR535在各物种中的分布的分析。
[0035] 图3表示Q-RTPCR检测0smiR535在不同时期花序（inflorescence)中的表达水 平。
[0036] 图4表示p0sMIR535::⑶S转化植物后，植物花序组织中的⑶S染色情况。
[0037] 图5表示pUBI: :0sMIR535转基因水稻籽粒增大。
[0038] 图6表示统计pUBI: :0sMIR535转基因材料籽粒的长度、宽度、高度及千粒重。
[0039] 图7表示农杆菌瞬时转化验证miR535可以降低0sSPL12的mRNA水平。
[0040] 图8表示qR-PCR的方法检测OsSPL家族成员。
[0041] 图9表示构建抗剪切靶基因m0sSPL12的示意图。
[0042] 图10表示qRT PCR转基因植株的鉴定。
[0043] 图11表示pUBI: :m0sSPL12转基因材料谷粒变小。A为谷粒对比照片；B为谷粒长 宽高及千粒重的统计。
[0044] 图12表示扫描电镜观察ZHIUpUBI: :0smiR535、pUBI: :0sSPL12外颖细胞并统计。
[0045] 图13表示0sSPL12蛋白亚细胞定位。
[0046] 图14、miR535的前体的序列结构。
【具体实施方式】
[0047] 本发明人以转基因技术为背景，研究了可能参与水稻种子大小调控的小RNA，从中 获得了是一个古老又保守的小RNA--miR535。本发明首次提出，植物中miR535基因在调 控植物种子发育中发挥重要作用，其能调控植物籽粒大小及重量，调控植株分蘖，以及调控 植物颖壳发育。miR535通过SPL12基因调控植物种子发育的生物功能，从而实现植物品种 改良。在此基础上完成本发明。
[0048] 本发明中，所述"植物"是表达miR535 (较佳地还表达其靶基因SPL)的植物；较佳 地，所述植物包括但不限于：禾本科植物、茄科植物、大戟科植物等。优选的，所述的植物是 禾本科植物。更优选的，所述植物包括（但不限于）：水稻、小麦、玉米、黑麦、高粱等。
[0049] 本发明人意外地发现，miR535基因参与了对于植物性状的调控，特别是提高植物 产量、增大植物种子、增大植物种子颖壳或增加植物分蘖数目。
[0050] 本发明中，miR535基因还包括具有与SEQIDNO. 1所示核苷酸序列高同源性的核 苷酸序列。其中，所述高同源性是指同源性>60%;较佳地，同源性>80%;更佳地，同源性 >90%或更高。
[0051] 本发明还提供包含miR535基因的多核苷酸序列的表达载体，优选植物表达载体； 更优选适合于进行后续转基因操作（如应用农杆菌的转基因操作）的表达载体。本领域的 技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载 体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻 译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0052] 本发明还提供遗传工程化的宿主细胞，其含有miR535的多核苷酸序列或含有包 含miR535多核苷酸序列的载体。
[0053] 宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方 法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官 可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。
[0054] 本发明提供了所述的miR535基因的用途，用于提高植物产量、增大植物种子、增 大植物种子颖壳或增加植物分蘖数目；用