于剪切植物细胞内的SPL3、SPL11、SPL12、SPL14 或SPL16基因，下调这些基因的表达；或用于增加植物种子外颖壳的细胞数或促进植物花 器官发育。过表达miR535可以实现上述性状的改良。较佳地，所述的植物是禾本科植物。
[0055] 本发明还涉及miR535基因的上调剂及其用途。由于miR535的上调剂可调节 miR535的表达和/或调节miR535的活性，因此，所述的miR535的上调剂也可通过对miR535 的影响来调节植物性状，从而达到改良植物的目的。
[0056] 任何可提高miR535的活性、增强miR535的稳定性、促进miR535的表达、延长 miR535有效作用时间的物质均可用于本发明，作为可用于调节植物产量、种子大小、分蘖 数、颖壳大小的有效物质。
[0057] 作为本发明的一种实施方式，miR535的核苷酸序列通过常规的方法克隆到适当的 载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述miR535的植物细胞中，使所 述的植物细胞表达miR535。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达miR535的植 物。优选的，利用农杆菌转化法将miR535的编码基因转入植物中。
[0058] 也可通过用强启动子驱动从而增强miR535基因的表达。或者通过增强子来增强 该miR535基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子、水稻、玉 米的Ubi启动子等。
[0059] 可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。
[0060] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0061] 实验材料
[0062] 1、植物品种
[0063]水稻（Oryzasativa)材料为梗稻日本晴（0?sativaL.ssp.japonica cv.Nipponbare)。在人工气候室培养，生长条件为12h光照，28°C;12h黑暗，24°C。光量子 通量密度为200~250UMm2S、
[0064] 2、菌株、质粒、试剂盒和化学品
[0065] 2. 1菌株
[0066]大肠杆菌（Escherichia coli) :XLl_Blue，质粒转化受体菌（Stratagene，CA, USA)。
[0067]农杆菌（Agrobacteriumtrumefaciens) :EHA105,根癌农杆菌，用于水稻转化。 GV3101，用于烟草转化。
[0068] 2. 2质粒载体
[0069]pMD18_T(TaKaRa，Dalian，China)，用于TA克隆，Ampr。
[0070]pUBI1301 (CAMBIA中心），具有Knf(菌株）和Hyg1^(植株），用于构建表达载体。
[0071]pCAMBIA1300+pBI101质粒：具有Knf(菌株）和Hyg1^ (植株）。用于构建启动子区 域驱动的⑶S报告基因载体，研究基因的表达模式。pCAMBIA1300+pBI101构建：pBIlOl的 ⑶S-NOS编码区的pCAMBIA1300 的T-Boader和Ubipromoter之间位点。
[0072]PA7-GFP获自德国马普分子植物生理学研究所，用于构建融合载体，研究基因的亚 细胞定位。
[0073] 2. 3引物及探针
[0074] 所涉及的引物及探针如表1。
[0075]表1
Promoter-miR535-R以高保真酶KOD扩增MIR535上游I. 2kb片段，产物经PST/Xbal酶切后 连入pCAMBIA1300+pBI101 质粒。
[0080]pUBI: : 0sMIR535 如下构建：
[0081]miR535 颈环结构基因序列：利用Clone-miR535-F和Clone-miR535-R从水稻ZHll 的基因组中扩增获得（114bp)。其中含有可在细胞内形成发卡结构RNA前体的DNA序列，序 列如下（94bp):
[0082]GGCGGTGACAACGAGAGAGAGCACGCCGGTGCGGCGGTCACGGTGAGCCGGCCCGCGGCGGCGTACCTG CGTGCTTTCTC_CGTTGTCACTGCC(SEQIDNO:2)。
[0083] 该序列在转入细胞内后，可以形成RNA前体，颈环结构如图14所示；序列如下 (94bp)：
[0084]GGCGGUGACAACGAGAGAGAGCACGCCGGUGCGGCGGUCACGGUGAGCCGGCCCGCGGCGGCGUACCUG CGUGCUUUCUC^C⑶腳CACUGCC(SEQIDNO: 3)。
[0085] 将包含miR535颈环结构的基因序列用引物Clone-miR535-F和Clone-miR535-R 以高保真KOD酶扩增，产物加A回收后克隆到pMD18-T(TaKaRa，Cat.D504A)中，应用KpnI 将片段克隆到PUN1301 (购自CAMBIA中心）的Ubiquitin启动子下游。
[0086] 35S: :miR156如下构建：以水稻ZHll的基因组为模板，将miR156基因用引物 Clone-miR156-F和Clone-miR156-R以高保真KOD酶扩增，平端连入 1301P(在PCAMBIA1301 的 10782BstXC插入CAMV35S启动子和多克隆位点（MCS:KpnI，SmaI，BamHI，XbaI，Sail， PstI)后获得1301P)的35S启动子下游。
[0087] 35S: :miR535如下构建：以水稻ZHl1的基因组为模板，将miR535基因用引物 Clone-miR535-F和Clone-miR535-R以高保真KOD酶扩增，平端连入1301P的35S启动子下 游。
[0088] 35S启动子驱动0sSPL12cDNA表达的质粒如下构建：以水稻ZHll的基因组为模 板，将0sSPL12cDNA基因用引物0sSPL12-0RF-F和0sSPL12-0RF-R以高保真KOD酶扩增，平 端连入1301P的35S启动子下游。
[0089] 35S启动子驱动0sSPL14cDNA表达的质粒如下构建：以水稻ZHll的基因组为模 板，将0sSPL14cDNA基因用引物0sSPL14-0RF-F和0sSPL14-0RF-R以高保真KOD酶扩增，平 端连入1301P的35S启动子下游。
[0090]pUBI: :m0sSPL12如下构建：定点突变采用两轮PCR的方法，第一轮分别用 Rm0sSPL12-l+Rm0sSPL12-3 与Un0sSPL12-2+Rm0sSPL12-4 进行扩增，第二轮选用第一轮的 PCR产物进行再扩增。突变产物经PCR测序验证，将片段克隆到pUN1301的Ubiquitin启动 子下游
[0091] 2. 5 其他
[0092]核酸分子量标准DL2000,DL15000 (TaKaRa);
[0093] 质粒抽提试剂盒（QIANGEN);
[0094] 快速限制性内切酶（Fermentas;Thomo);
[0095]T4DNA连接酶（Promega);
[0096]KOD-pIusDNA聚合酶（ToYoBo);
[0097]ReverseTranscriptionSystem(TaKaRa)；
[0098] 脱氧核苷酸引物（Sangon，上海）；
[0099] Trizol及RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司；
[0100]SYBRGreenI反应试剂（ToYoBo);
[0101]⑶S底物X-GluA(X-glucronide，B-6650,Sigma公司）用二甲基甲酰胺（DMF) 作溶剂，配成40mg/ml的母液，-20°C保存。反应缓冲液IOOmMNaH2P04/Na2HP04,0. 5mM K3[Fe(CN) 6]，0.5mMK4[Fe(CN)4LIOmMEDTA。
[0102] 实验方法
[0103]I、植物材料鉴定
[0104]I. 1水稻基因组DNA的提取
[0105]使用CTAB法（2%CTAB，I. 4M/L NaCl，20mM EDTA，100mM/L Tris. HC1，PH8. 0)提 取：
[0106] (1)取2cm的水稻叶片放入2mL的离心管中，用液氮冷冻后用研磨机磨碎后加入 200iiL的CTAB抽提液。
[0107] (2)65。〇加热451^11。
[0108](3)加入等体积氯仿，混匀，室温静置IOmin。
[0109] (4) 12000rpm，离心15min，取上清至新的EP管。
[0110] (5)加入等体积的异丙醇，混匀，-20°C沉淀30min。
[0111](6) 12000rpm离心IOmin,弃上清，70%乙醇洗涤沉淀两次。
[0112] (7)离心弃上清后，干燥，用适量的水溶解。
[0113]PCR鉴定使用30yL体系，以前文所述基因组DNA为模板，用潮霉素或卡那霉素特 异性的引物办8-1/办8-2、恥《1-1/恥《1-2,601：退火，721：延伸40 8。1.5%琼脂糖电泳检 测PCR产物。
[0114]I. 2SouthernBlot鉴定T-DNA插入数目
[0115] (I)CTAB法提取野生型和突变体DNA，并测量其浓度。
[0116] (2)用KpnI、Hindlll、XbaI三种酶配制200iiL单酶切体系。其中每个酶切体 系加入30iigDNA和10ill酶于37°C酶切至基因组DNA主带消失。酶切完全后两倍体积乙 醇和十分之一体积的3M醋酸钠沉淀Ih，溶至30iiL水中。
[0117](3)制作无EB的1. 0%琼脂糖胶。将酶切过的DNA加入适量上样缓冲液后上样。
[0118] (4)转膜和杂交方法见分子克隆。
[0119] 2、基因表达的分析
[0120] 2.1水稻RNA提取
[0121] (1)取水稻材料（约IOOmg)于2ml离