携带muc-1抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及携带粘蛋白（Mucin 1，MUC-1)抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与其在制备抗MUC-I阳性的肿瘤 药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 腺相关病毒（Adeno-associatedvirus;AAV)的基因结构已经被鉴定。1983 年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段（上游5'端片段，下游3'端片段） (SamulskiRJ,SrivastavaA,BernsKI,MuzyczkaN.Rescueofadeno-associated virusfromrecombinantplasmids:genecorrectionwithintheterminalrepeats ofAAV.Cell. 33:135-143.)。1984 年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒的 复制蛋白（rep)基因和包膜蛋白（cap)基因（l.HermonatPL,LabowMA,Wright R,BernsKI,MuzyczkaN.Geneticsofadeno-associatedvirus:isolationand preliminarycharacterizationofadeno-associatedvirustype2mutants.J Virol.51:329-339. 2.Hermonat,P.L. ,andMuzyczka,N.Useofadeno-associatedvirus asamammalianDNAcloningvector:transductionofneomycinresistanceinto mammaliantissueculturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 81:6466-6470.)〇 1986 年，Labow等人鉴定了位于上游5'端片段和rep基因之间的p5启动子（LabowMA,Hermonat PL,BernsKI.Positiveandnegativeautoregulationoftheadeno-associatedvirus type2genome.JVirol. 160:251-258.)〇
[0003] 1984年，美国PaulL.Hermonat率先证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗 (Hermonat,P.L. ,andMuzyczka,N.Useofadeno-associatedvirusasamammalian DNAcloningvector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissue culturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 81:6466-6470.)。目前，主要是欧美国家在进 行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管理局统计，现有十 余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进彳丁，主要是将携带治疗基因的AAV病毒注入 患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。主要针对治疗的疾病有帕 金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿 瘤性疾病。2012年11月2日欧盟批准UniQure公司的Glybera产品在欧盟27个成员国使 用，这是西方国家第一个获批准的基因治疗药物，它是利用腺相关病毒I型（AAV-I)携带外 源基因用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病（LPLD)的基因药物。
[0004]AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒（如腺病毒）的基因产物辅助， 才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。目前AAV可分为12种血清型（AAV-1~AAV-12)。 其中，2型腺相关病毒（AAV-2)载体因具有无致病性、宿主范围广、目的基因长期表达等 优点而成为当前基因治疗中最有潜力的病毒载体之一。AAV-2基因组全长约4700碱基 对（bp)，两端为末端重复片段（TR)，中间为病毒的结构基因，包括复制蛋白（Rep)和包膜 蛋白（Cap)基因。由于存在AAV病毒自身的不稳定性及其携带外源性基因（治疗基因） 长度有限等方面缺陷，因此有必要对其进行基因重组形成重组腺相关病毒（recombinant adeno-associatedvirus，rAAV)。现有大量研究表明，将AAV基因组中的结构基因删除，可 明显增加外源性基因的容量。此外，将具有治疗作用的外源性基因插入rAAV中，制备成具 有感染性的rAAV病毒颗粒。
[0005] 如何构建可用于制备治疗疾病的药物的重组腺相关病毒及其相关产品是本领域 技术人员努力的方向。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种稳定性高、携带粘蛋白（MUC-I)抗原基 因的重组腺相关病毒（RecombinantAdeno-associatedvirus;rAAV)载体及构建方法与应 用。
[0007] 本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
[0008] -种携带MUC-I抗原基因的重组腺相关病毒载体，是将腺相关病毒载体中的腺相 关病毒的结构基因替换为MUC-I抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。
[0009] 优选地，可将所述重组腺相关病毒载体中的p5启动子替换为下述三种启动子中 的一种：巨噬细胞病毒启动子、P-肌动蛋白启动子和SV40早期启动子。
[0010] -种携带MUC-I抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，将腺相关病毒载体 中的腺相关病毒的结构基因剔除，然后在剔除的位置上插入MUC-I抗原基因，得到重组腺 相关病毒载体。
[0011] 优选地，还包括以下步骤：将所述重组腺相关病毒载体中的P5启动子替换为下述 三种启动子中的一种：巨噬细胞病毒启动子、P-肌动蛋白启动子和SV40早期启动子。
[0012] 优选地，包括以下步骤：
[0013] 1)改建AAV-2型pBR322质粒：使用限制性内切酶Bst98I和Hpa I将AAV-2型 PBR322质粒中的AAV-2型腺相关病毒中的结构基因切除，然后将含有限制性内切酶EcoR I 和EcoR V酶切位点的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入所述AAV-2型pBR322质粒 中，保留两端的TR序列或分别在两端完整的TR序列的第75位核苷酸序列处均插入9个核 苷酸CTGCGCTGG组成的片段；
[0014] 2)将启动子插入步骤1)得到的改建的AAV-2型pBR322质粒中，构建携带有启动 子的AAV2型pBR322质粒；所述启动子为下述四种启动子中的一种：p5启动子、巨噬细胞 病毒启动子、P-肌动蛋白启动子和SV40早期启动子；
[0015] 3)获取MUC-IcDNA ;
[0016] 4)将步骤2)构建的所述携带有启动子的AAV-2型pBR322质粒和步骤3)得到的 MUC-lcDNA分别用限制性内切酶BamHI和PstI进行酶切，然后进行DNA连接反应，得到携 带有所述启动子和MUC-I抗原基因的重组腺相关病毒载体。
[0017] 优选地，所述步骤3)中包括以下步骤：31)从MUC-I抗原阳性的肿瘤组织中提 取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA ;32)以所述总cDNA为模板，在引物 I :GCCTGCCTGAATCTGTT和引物2 :AACCTGAGTGGAGTGG的引导下进行PCR扩增，得到所述 MUC-lcDNA。
[0018] -种与携带MUC-I抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品，包括MUC-I重组 腺相关病毒的质粒载体、MUC-I重组腺相关病毒的病毒载体、被所述MUC-I重组腺相关病毒 的病毒载体感染或转染的细胞系；所述MUC-I重组腺相关病毒的质粒载体由所述的或者所 述的构建方法制得的携带MUC-I抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述MUC-I重组腺 相关病毒的病毒载体由所述MUC-I重组腺相关病毒的质粒载体进行细胞培养得到。
[0019] -种与携带MUC-I抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品的制备方法， MUC-I重组腺相关病毒的质粒载体的制备：将所述的或所述的构建方法制得的携带MUC-I 抗原基因的重组腺相关病毒载体导入基因工程大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含100yg/ mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到MUC-I重组 腺相关病毒的质粒载体；
[0020]MUC-I重组腺相关病毒的病毒载体的制备：以所述MUC-I重组腺相关病毒的质粒 载体和pHelper质粒共转染AAVp细胞得到MUC-I重组腺相关病毒的病毒载体；
[0021] MUC-I重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染的细胞系的制备：用所述MUC-I 重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染单核细胞或树突状细胞，所述细胞系包括单核细 胞-树突状细胞系。
[0022] -种所述的携带MUC-I抗原基因的重组腺相关病毒载体或者相关产品在制备抗 肿瘤药物中的应用。
[0023] 本发明与现有技术对比的有益效果是：
[0024] 本发明提供了一种稳定性高、携带MUC-I抗原基因的重组腺相关病毒（（以下将 "携带MUC-I抗原基因的重组腺相关病毒"称为AAV/MUC-1)载体。本发明的重组腺相关病毒 载体可将其携带的MUC-I抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，存在MUC-I抗原基 因的细胞被用于刺激免疫系统的效应细胞（不局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞）。实验证 明，被本发明的AAV/MUC-1的病毒载体感染的树突状细胞所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在 患者体内可有效地抑制相关恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，因而，本发明的AAV/ MUC-I载体或与本发明AAV/MUC-1载体相关的产品可被用于制备抗MUC-I阳性的恶性肿瘤 的细胞免疫治疗。本发明在恶性肿瘤的临床治疗和应用中具有重要的理论和实际意义，应 用前景广阔。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明【具体实施方式】的AAV/MUC-1载体的结构示意图。
[0026] 图2为本发明【具体实施方式】的构建AAV/MUC-1载体制备具有感染性的AAV/MUC-1 的病毒载体的流程图。
[0027] 图3为本发明【具体实施方式】的MUC-I基因克隆及AAV/MUC-1载体的双酶切鉴定结 果图。
[0028] 图4为本发明【具体实施方式】所获得的MUC-I抗原基因序列与美国NCBIGeneBank 公布的基因序列比较图。
[0029] 图5为本发明【具体实施方式】的AAV/MUC-1的病毒载体的病毒滴度检测结果图。
[0030]图6为本发明【具体实施方式】的AAV/MUC-1的病毒载体感染肿瘤患者单核细胞为基 础的杀灭肿瘤实验流程图。
[0031] 图7a_7d分别为本发明【具体实施方式】的分别含不同的启动子的AAV/MUC-1的病毒