载体感染外周血单个核细胞的效率检测结果图。
[0032] 图8a'为本发明【具体实施方式】的启动子为SV40早期启动子的AAV/MUC-1的病毒载 体感染的DC表达CD80水平的流式细胞技术检测结果图；以图8a中无刺激的DC表达DC80 为对照。
[0033] 图8b'为本发明【具体实施方式】的启动子为SV40早期启动子的AAV/MUC-1的病毒载 体感染的DC表达CD83水平的流式细胞技术检测结果图；以图8b中无刺激的DC表达DC83 为对照。
[0034] 图8c'为本发明【具体实施方式】的启动子为SV40早期启动子的AAV/MUC-1的病毒载 体感染的DC表达CD86水平的流式细胞技术检测结果图；以图8c中无刺激的DC表达DC86 为对照。
[0035] 图9a为本发明【具体实施方式】的AAV/MUC-1的病毒载体感染的DC所诱导的CTL杀 伤MUC-I抗原阳性的肿瘤细胞以及杀伤特异性的检测结果图。
[0036]图9b为本发明【具体实施方式】的AAV/MUC1的病毒载体感染的DC所诱导的CTL具 有MHCI类分子限制性的检测结果图。
[0037] 图10为本发明【具体实施方式】的6例经AAV/MUC-1的病毒载体感染的DC所诱导的 CTL治疗后乳腺癌患者血清肿瘤标志物CA15-3抗原水平的变化情况示意图。
[0038] 图11为本发明【具体实施方式】的5例AAV/MUC-1的病毒载体感染的DC所诱导的 CTL治疗后胃癌癌患者血清肿瘤标志物CA19-9抗原水平的变化情况示意图。
【具体实施方式】
[0039] 下面对照附图并结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。
[0040] 发明人已经成功地将携带AAV2型全基因组DNA的pBR322质粒（pBR-AAV2)中的 AAV-2的包括rep和cap基因在内的全部结构基因删除，保留末端重复片段和p5启动子，或 者仅保留末端重复片段，并插入寡核苷酸片断，以提高rAAVDNA复制的效率和rAAV病毒的 稳定性，由此获得AAV载体的基本骨架。所应用的AAV-2载体具有p5启动子，将MUC-I抗 原基因插入其中。为提高MUC-I抗原基因的转录水平，还可将该MUC-I抗原基因插入已经 成功构建的启动子为巨细胞病毒（CMV)启动子、猴空泡病毒40 (SV40)早期启动子、(6-肌 动蛋白启动子取代了 P5启动子的AAV-2载体中，也即本发明的携带MUC-I抗原基因的重 组腺相关病毒载体的启动子为P5启动子或CMV启动子或P-肌动蛋白启动子或SV40早 期启动子。此外，在此基础上成功地制备了具有感染性的rAAV病毒颗粒（参见中国专利 ZL201110125683.X)。为研制新的rAAV产品奠定了基础。
[0041] 粘蛋白（MUC-I)抗原是一种高糖化、高分子量的蛋白，又称附膜蛋白，是跨膜分 子，也可称为糖类抗原CA15-3,是一种肿瘤相关抗原。MUC-I除了可以使用免疫组化技术 进行筛查，还可以针对CA15-3进行血清学检查，而且CA15-3的表达量与乳腺癌患者的瘤负 荷量成正相关。正常情况下，MUC-I主要在乳腺、胰腺、消化道、生殖道等组织、器官的上皮 细胞中表达，集中位于腺上皮细胞的腔面，胞质未见表达，不易被免疫系统识别。癌变后细 胞中MUC-I表达与正常细胞不同，主要表现为：①表达量显著升高，可达正常时的10倍以 上，且与肿瘤的恶性程度呈正相关；②均匀地分部在细胞表面，且胞质中也可见；③糖基化 不完全，使正常情况下隐蔽的表位暴露，出现新的表位，具有免疫原性，成为免疫细胞攻击 的靶点。MUC-I在癌变细胞中由于其构型改变而出现了新的抗原表位。本文针对MUC-I的 ACTL技术正是以新的MUC-I抗原表位为靶点，从而特异性地杀死肿瘤细胞，而对正常细胞 无杀伤作用。
[0042] 本发明的AAV/MUC-1载体即是在发明人已经成功构建的AAV-2载体的骨架中插入 MUC-I抗原基因得到重组腺相关病毒载体，与该载体相关的产品包括质粒、病毒和细胞系。 其中，MUC-I为肿瘤相关抗原基因。
[0043]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：((MolecularCloning:ALaboratoryManual))(Sambrook,J. ,Russell,Davidff.,Molecular Cloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor)。所用引物、 DNA序列合成及DNA序列测定均由美国LifeTechnologies公司完成。
[0044] 实施例1、携带MUC-I抗原基因的重组腺相关病毒（可命名为AAV/MUC-1)载体 AAV/MUC-1的构建及鉴定
[0045] 一、材料及其来源：
[0046] 1.四种具有不同启动子的AAV2型（AAV-2)pBR322质粒（pBR-AAV2:由发明人构 建成功（参见中国专利ZL201110125683.X，，0056~0059段pBR-AAV2质粒的改建、PCR扩 增启动子、将扩增的启动子插入改建的PBR-AAV2质粒中等内容）。四种启动子分别为AAV 的p5、CMV的启动子、SV40早期启动子和人(6-肌动蛋白（P-actin)启动子。该质粒的特 点为两端完整的末重复端片断（TR)序列，或分别在两端TR的第75位核苷酸序列处均插入 9个核苷酸CTGCGCTGG片段，目的是提高重组AAV病毒（rAAV)的稳定性以及提高病毒的复 制效率，无任何AAV结构基因。
[0047] 2.人肺癌细胞（A549):来源于美国ATCC公司，为MUC-I抗原阳性细胞株。
[0048] 3.基因扩增核苷酸引物：根据美国基因库中公开发表的MUC-I基因序列设计（美 国NCBI基因库：NM_002456. 5)。
[0049] 二、构建本实施例携带MUC-I抗原基因的重组腺相关病毒载体（如图1和2所示）。
[0050] 本实施例所提供的构建方法，是使用常规的基因重组的方法，使用限制性内切酶 先将AAV-2载体骨架DNA切断，再运用DNA连接技术，将特异抗原基因MUC-I与被切断的 AAV-2载体DNA进行连接，得到携带MUC-I抗原基因的重组腺相关病毒载体，S卩AAV/MUC-1 载体。该AAV/MUC-1载体的启动子为p5启动子或巨噬细胞病毒（CMV)启动子或beta肌动 蛋白启动子或SV40早期启动子。具体过程包括以下步骤：
[0051] 1.获取总cDNA，具体方法为：采用Trizol试剂（美国LifeTechnology公司生产） 获取A549细胞株的总mRNA。首先收集MUC-I抗原阳性的A549细胞株，加入5mlTrizol, 按照其说明书进行操作。离心获取上清液后，以75% (V/V)乙醇洗涤二次，再加入无水乙 醇，离心沉淀。沉淀物（即总mRNA)以去离子水溶解，将浓度调至IOng/y1，得到总mRNA溶 液。以10y1总mRNA溶液为模板，进行逆转录反应，合成总cDNA，逆转录反应的反应体系以 25y1 为例，包括：0? 5ygoligo(dT) 15 (美国Promega公司）、0? 5mMdNTPs(美国Promega 公司）以及200UM-MLV逆转录酶（美国Promega公司）。反应条件为37°C，1小时，得到总 cDNAo
[0052] 2?获取MUC-lcDNA，具体方法为：总cDNA在引物1(如SEQIDN0:1): GCCTGCCTGAATCTGIT和引物 2 (如SEQIDNO: 2):AACCTGAGTGGAGTGG的引导下进行PCR扩 增，得到MUC-lcDNA。PCR扩增条件为：先94°C4分钟；再94°C30秒，60°C35秒，72°C70 秒，共30个循环；最后72°C8分钟，反应结束后，对PCR产物进行1. 2 % (W/V)琼脂糖凝胶 电泳检测，在928bp处出现一条预期的特异性条带，将该目的条带回收并纯化后得到长度 为928bp的MUC-IcDNA(如SEQIDN0:3)，如图3所示，图3中的A图是从A549细胞株cDNA 中PCR扩增MUC-I基因的结果。其中1是MUC-lcDNA，长度为928bp;2是DNA分子量标准。 B图是构建的重组腺相关病毒AAV/MUC1载体的双酶切鉴定结果，其中1-4是4个阳性克隆； 5是DNA分子量标准。再进行DNA序列测定，其核苷酸序列如图4所示，MUC-IcDNA序列与 美国NCBIGeneBank公布的基因序列99%同源，进一步证明PCR扩增的MUC-I基因序列正 确。
[0053] 3.构建AAV/MUC-1载体：分别对携带4种不同启动子的pBR-AAV2质粒和 MUC-lcDNA分别用限制性内切酶进行酶切后，进行DNA连接反应。所用限制性内切酶均购 自美国Promega公司。酶切反应体系为：lygpBR-AAV2质粒或者MUC-lcDNA;10U限制性 内切酶BamHI和PstI(购自美国Promega公司），2. 5ylIOX缓冲液C以及19. 5yl去 离子水；反应条件为：在37°C下水浴4小时。连接反应体系为：500ng酶切后的pBR-AAV2 质粒，300ngMUC-lcDNA，IOIUT4DNA连接酶（购自美国Promega公司），I. 5yIIOXT4DNA 连接缓冲液以及11. 5y1去离子水；反应条件为：在4°C下8小时。分别得到携带有AAV的 P5启动子和MUC-lcDNA的重组腺相关病毒载体、携带有CMV启动子和MUC-lcDNA的重组腺 相关病毒载体、携带有SV40早期启动子和MUC-lcDNA的重组腺相关病毒载体、以及携带有 0 -肌动蛋白启动子和MUC-lcDNA的重组腺相关病毒载体。
[0054] 4、将连接后的AAV/MUC-1载体分别导入基因工程大肠杆菌（E.coli)DH5a感受态 细胞（美国Invitrogen公司），用含100yg/mL氨节青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取 白色单菌落，提取质粒并纯化，得到大量的AAV/MUC-1的质粒载体。
[0055] 三、重组腺相关病毒的质粒载体的鉴定
[0056] 1.双酶切鉴定：将上述的单克隆质粒进行BamHI和PstI双酶切鉴定，以能否酶切 出MUC-lcDNA为鉴定标准。对双酶切产物进行1.2 % (W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，在928bp 处出现一条特异性条带即可判定为AAV/MUC-1的质粒载体构建成功（如图3所示）。
[0057] 2.DNA序列测定：将AAV/MUC-1进行DNA序列测定。其测序结果的核苷酸序列如 图4所示，进一步证明构建AAV/MUC-1的质粒载体成功。
[0058] 实施例2、重组腺相关病毒（rAAV)的病毒载体的制备及病毒滴度测定（如图2、5 所示）
[0059] 材料及其来源：
[0060]A.实施例1构建的AAV/MUC-1载体。
[0061]B?含AAV的R印基因和Lip/Cap基因的辅助质粒pHelper:由美国阿肯色大 学医学院附属