线粒体基因组检测方法及引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及线粒体基因组检测方法及引物。
【背景技术】
[0002] 随着科学技术的迅猛发展，DNA检验技术在法医学领域中的作用越来越重要。1985 年，英国遗传学家A.J.Jeffreys教授应用DNA指纹检验帮助认定了某地的强奸案罪犯，侦 破了此案，开启了DNA检验技术在法医领域的应用，极大地推动了法医学的发展。从此，DNA 检验技术在法医学领域得到了广泛应用，如凶案现场残留物证的鉴定、尸源认定、亲子鉴 定、性别鉴定、建立罪犯基因指纹库等诸多方面。
[0003] 为了给案件侦查提供准确可靠的依据，经常需要进行人体组织物证的鉴定。然而， 对于现场遗留的人体软组织已经遭到严重破坏的情况下，核DNA发生严重降解，已经无法 满足物证鉴定要求，这就需要进行线粒体DNA分析。线粒体DNA广泛存在于人体各种组织， 包括毛发，指甲等角化组织中，具有较核DNA片段短，拷贝数多，突变率极高，母系遗传等特 点。对现场遗留的毛发，指甲，骨骼，牙齿等进行线粒体DNA分析，并用于法医个体识别及亲 缘认定，使法医学中陈旧，降解，微量检材的鉴定得以解决，能够给案件侦破提供更多的线 索和强有力的科学依据。在强奸及凶杀案现场，遗留较多的物证就是血迹，毛发，指甲等；在 失踪多年的无名尸、碎尸案及重大灾难中，尸体通常已经白骨化，核DNA提取困难。
[0004] 人类线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)是唯一分布于细胞核外的DNA，具 有自我复制，转录和编码的功能。1981年，剑桥大学的Anderson等公布了线粒体基因组 的全长序列，该序列被称为Anderson序列或剑桥序列。mtDNA全长由16596bp组成，呈双 链闭合环状，分为编码区和控制区。控制区由l〇22bp组成，其中置换环区（displacement loopregionD环区）包括三个高变区，分别是16024_16365bp的高变1区（hypervariable regionI，HVI)，73_340bp的高变2 区（hypervariableregionII，HVII)和438_574bp 的高变3区（hypervariableregionIII，HVIII)。这三个可变区的多态性在个体间表现出 高度差异性，对法医学个体识别及亲缘鉴定具有重要的意义。
[0005] 目前国际法医学界的线粒体DNA的检测范围主要集中在高变区，Alves-SilvaJ 等和YaoYG等报道了HVI和HVII区域的序列变异。但由于线粒体具有异质性，编码区 相对控制区大15倍，显然存在大量信息，对个体身份识别具有十分重要的作用。法医物证 鉴定的DNA检测技术有很多，如DNA指纹技术、限制性片段长度多态性（RFLR)、单链构象多 态性（SingleStrandConformationalPolymorphism，SSCP)、杂交技术等，但均存在诸多缺 点，有的特异性差，灵敏度低，有的准确度低，有的对样本的要求高。许传超等，应用基质辅 助激光解吸电离飞行时间质谱技术（matrixassistedIasterdesorptionionizationtime offlightmassspectrometry,MALDI一T0FMS)对HVI区基因突变频率进行筛查，该法不能 获得线粒体DNA的序列信息。张茂雷等公布了口腔脱落细胞的线粒体DNA检测方法，检测 的含有核DNA的样本，而法医鉴定中，毛发，指甲这类角化组织样本比较常见，核DNA极少甚 至已经完全降解，用该法可能不适用于这类样本的检测。。
[0006] 目前法医领域还没有可以广泛应用的检测线粒体全长序列的方法，因此，如何检 测法医鉴定中这类微量检材特殊样本的线粒体DNA全长序列，使其快速应用于法医学领 域，是一个亟待解决的问题。
【发明内容】
[0007] 本发明一个目的是提供一种用于扩增线粒体基因组的引物组。
[0008] 本发明提供的用于扩增线粒体基因组的引物组，包括4个引物对；
[0009]所述4个引物对分别为由MitlF引物和MitlR引物组成的引物对1、由Mit2F引 物和Mit2R引物组成的引物对2、由Mit3F引物和Mit3R引物组成的引物对3以及由Mit4F 引物和Mit4R引物组成的引物对4 ;
[0010] 所述MitlF引物的核苷酸序列为序列表中序列1 ;
[0011] 所述MitlR引物的核苷酸序列为序列表中序列2 ;
[0012] 所述Mit2F引物的核苷酸序列为序列表中序列3 ;
[0013] 所述Mit2R引物的核苷酸序列为序列表中序列4 ;
[0014] 所述Mit3F引物的核苷酸序列为序列表中序列5 ;
[0015] 所述Mit3R引物的核苷酸序列为序列表中序列6 ;
[0016] 所述Mit4F引物的核苷酸序列为序列表中序列7 ;
[0017] 所述Mit4R引物的核苷酸序列为序列表中序列8。
[0018] 上述引物组中，由上述4个引物对组成。
[0019] 其中，用每一对引物分别进行PCR扩增。
[0020] 本发明的另一个目的是提供一种用于扩增线粒体基因组的PCR试剂。
[0021] 本发明提供的PCR试剂，包括含有上述引物对1的PCR试剂1、含有上述引物对2 的PCR试剂2、含有上述引物对3的PCR试剂3和含有上述引物对4的PCR试剂4。
[0022] 上述PCR试剂，由含有上述引物对1的PCR试剂1、含有上述引物对2的PCR试剂 2、含有上述引物对3的PCR试剂3和含有上述引物对4的PCR试剂4组成。
[0023] 上述PCR试剂中，引物对中的每条引物在其对应的PCR试剂中的工作液浓度为 10UM0
[0024]每一种PCR试剂包括 10XLAPCRbufferII、dNTPMixture、对应的引物对、LATaq 和水。
[0025] 含有上述引物或含有上述PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。
[0026] 上述引物、上述PCR试剂在制备用于法医鉴定检材的产品中的应用也是本发明保 护的范围；
[0027] 或上述引物、上述PCR试剂在制备用于法医鉴定检材的线粒体基因组测序产品中 的应用也是本发明保护的范围；
[0028] 或上述引物、上述PCR试剂在制备用于线粒体基因组测序的产品中的应用也是本 发明保护的范围；
[0029] 或上述引物、上述PCR试剂在线粒体基因组扩增中的应用也是本发明保护的范 围；
[0030] 或上述引物、上述PCR试剂在线粒体基因组测序中的应用也是本发明保护的范 围；
[0031] 或上述引物、上述PCR试剂在制备用于法医鉴定个体身份识别产品中的应用也是 本发明保护的范围。
[0032] 上述应用中，所述检材为角化组织或骨头或牙齿或血斑或口腔脱落细胞。
[0033] 上述应用中，所述角化组织为无毛囊毛发或指甲。
[0034] 上述应用中，所述检材的样本量为如下：
[0035] 所述无毛囊毛发的数量不少于1根、总长度不小于5cm ;具体为无毛囊毛发的数量 为1根、长度为5-lOcm;
[0036] 或所述指甲的表面积不小于0. 2cm2;具体为指甲的表面积为0. 2-0. 5cm2;
[0037] 或所述血斑的直径不小于1cm，具体为血斑的直径为l_5cm。
[0038] 上述应用中，所述广品为试剂盒。
[0039] 本发明的第三个目的是提供一种线粒体基因组DNA的扩增方法，用上述4个引物 对对线粒体基因组DNA进行PCR扩增。
[0040] 本发明的第四个目的是提供一种线粒体基因组DNA测序方法。
[0041] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0042] 1)分别用上述4个引物对对线粒体基因组DNA进行PCR扩增，得到4种PCR扩增 产物；
[0043] 2)以所述4种PCR扩增产物构建待测序线粒体DNA文库；
[0044] 3)测序所述待测序线粒体DNA文库，得到线粒体基因组DNA序列。
[0045] 上述方法中，所述检材为角化组织或骨头或血斑或口腔脱落细胞或牙齿。
[0046] 上述方法中，所述角化组织为无毛囊毛发或指甲。
[0047] 上述方法中，所述检材的样本量为如下：
[0048] 所述无毛囊毛发的数量不少于1根、总长度不小于5cm ;具体为无毛囊毛发的数量 为1根、长度为5-lOcm;
[0049] 或所述指甲的表面积不小于0. 2cm2;具体为指甲的表面积为0. 2-0. 5cm2;
[0050] 或所述血斑的直径不小于1cm，具体为血斑的直径为l-5cm。
[0051] 步骤2)中，所述构建包括如下步骤：
[0052]A、混合所述4种PCR扩增产物，得到混合DNA片段；
[0053]B、打断所述混合DNA，得到断裂后DNA片段；
[0054]C、将所述断裂后DNA片段依次经末端修复、连接接头、片段选择，选取460_480bp DNA片段构成待测序线粒体DNA文库。
[0055] 步骤B中，所述断裂后DNA片段为200-500bp。
[0056] 上述方法中，步骤3)测序是以2100检测结果为准，应用IonPGM测序仪按照PGM indexSE400程序对待测序线粒体DNA文库进行测序，获得线粒体全长序列。
[0057] 本发明的实验证明，本发明通过针对线粒体基因组设计4对引物，并扩增、建库、 测序，最终得到样本的线粒体全长序列，得到更准确的线粒体序列信息；另外，本发明采用 先进的第二代高通量测序技术检测，一次可以检测多达上千个样品；更重要的是本发明检 测样本为法医