A;
[0151] 配置二硫苏糖醇（DTT)提取液：将IgDTT溶入6. 66mL超纯水中。充分溶解后分 装，-20°C保存备用。用QJA棚讲'DNAInvestigator试剂盒和二硫苏糖醇（DTT)提取液提 取指甲样品中的基因组DNA，详述如下：
[0152] 指甲样品的消化：加入300iiLBufferATL、20iiL蛋白酶K和20iiLDTT，涡旋振 荡混合10秒，然后放置在恒温混匀器中，56°C以900rpm振摇2. 5小时。
[0153] 指甲样品浓度为8. 16ng/iiL，_20°C保存备用。
[0154] 二、测序样本制备
[0155] 1、设计扩增线粒体基因组DNA的引物：与实施例1相同；
[0156] 2、扩增线粒体基因组DNA:
[0157] 采用实施例1的二的2的方法，分别以1111、2111、3111和41114旨甲的基因组0嫩 为模板，分别用Mitl、Mit2、Mit3、Mit4引物对进行扩增。
[0158] 结果如图1-4所示，图1-4分别为IiiL、2iiL、3iiL和L模板在4对引物扩增 下的产物，Marker片段从下到上依次为：lOOObp，1500bp，2000bp，3000bp，4000bp，5000bp， 600(^口，800(^口，1000(^口，4对引物扩增产物組衍、]\1行2、]\1^3、]\1^4的大小分别为 ：3855匕口、 4852匕？、4852匕？和4961匕？。从图中可以看出，图1中当模板为1111时，4段产物虽然全部 出现目的条带，但条带很弱，特别是Mit2产物不能满足后续实验要求，当模板分别为2yL， 3yL，4yL时，4段产物都可以扩增出明显的目的条带，且产物的量逐步增多，因此2yL模 板就可以获得需要的目的片段，并且满足后续实验需要。
[0159] 3、线粒体DNA文库构建：与实施例1相同；
[0160] 应用2100Expert_HighSensitivityDNAAssay对待测序文库进行质检，检测峰 图如图6所示，结果如表10所示：
[0161] 表10为待测序线粒体DNA文库片段结果[0162]
[0163] 上述结果符合上机文库质量要求，其余文库质控要求同PGM上机文库需达到的要 求。
[0164] 4、上机测序：与实施例1相同；
[0165] 5、数据分析
[0166] 用Anderson作为线粒体基因组参考序列，测序结果与参考序列进行比对，得比对 率为99. 14%，覆盖度为100%，证明已测得线粒体全长序列。
[0167] 进行线粒体全长序列多态性分析，具体分析结果详见下表11.
[0168] 表11为线粒体全长序列多态性分析
[0169]
[0171] 可以看出，用本发明的方法能够基于二代测序技术检测微量样品，如指甲的线粒 体基因组DNA。
[0172] 因此推测，本发明的方法可以用于基因组数量少的样品，包括无毛囊毛发、指甲、 骨头、血斑、口腔脱落细胞等。
[0173] 对比例1、用2对引物扩增后测序线粒体基因组
[0174] -、基因组DNA提取
[0175] 采用实施例1的1根长约5cm的不带毛囊毛发的基因组DNA和实施例2中的1个 长约lcm、宽约0. 2cm的指甲的基因组DNA;
[0176] 以1根长约5cm带毛囊毛发为对照，采用实施例1的方法提取其基因组DNA。
[0177] 二、测序样本制备
[0178] 1、设计扩增线粒体基因组DNA的引物
[0179] 针对线粒体全长应用参考文献中的引物序列合成两对引物，引物序列如下：
[0180]Mit5F:TCTATCACCCTATTAACCACTCACGGGAGCT(序列 9)
[0181]Mit5R:GATACAGTTCACTTTAGCTACCCCCAAGTGTT(序列 10)
[0182]Mit6F:TGAGGCCAAATATCAITCTGAGGGGC(序列 11)
[0183]Mit6R:TTTCATCATGCGGAGATGTTGGATGG(序列 12)
[0184] 2、扩增线粒体基因组DNA:
[0185] 以2ul不带毛囊毛发基因组DNA为模板，分别用上述Mit5F/Mit5R和Mit6F/Mit6R 为引物进行PCR扩增，得到不带毛囊毛发线粒体DNAPCR产物Mit5和Mit6;
[0186] 以2ul指甲基因组DNA为模板，分别用上述Mit5F/Mit5R和Mit6F/Mit6R为引物 进行PCR扩增，得到指甲线粒体DNAPCR产物Mit5和Mit6。
[0187] 以2ul带毛囊毛发基因组DNA为模板，分别用上述Mit5F/Mit5R和Mit6F/Mit6R 为引物进行PCR扩增，得到带毛囊毛发线粒体DNAPCR产物Mit5和Mit6。
[0188] 上述PCR产物电泳，结果如图7所示，Marker片段从下到上依次为：310bp，603bp， 872bp，1078bp，1353bp，2027bp，2322bp，4361bp，6557bp，9416bp, 23130bp，毛囊毛发的PCR 产物Mit5的大小为16000bp，毛囊毛发的PCR产物Mit6大小为16000bp;而不带毛囊毛发 和指甲均无目的片段扩增。
[0189] 说明不带毛囊的毛发和指甲用两对引物扩增无法得到线粒体全长序列，更无用说 后期的建库测序了。
【主权项】
1. 一种用于扩增线粒体基因组的引物组，包括4个引物对； 所述4个引物对分别为由MitlF引物和MitlR引物组成的引物对1、由Mit2F引物和 Mit2R引物组成的引物对2、由Mit3F引物和Mit3R引物组成的引物对3以及由Mit4F引物 和Mi t4R引物组成的引物对4 ; 所述MitlF引物的核苷酸序列为序列表中序列1 ; 所述MitlR引物的核苷酸序列为序列表中序列2 ; 所述Mit2F引物的核苷酸序列为序列表中序列3 ; 所述Mit2R引物的核苷酸序列为序列表中序列4 ; 所述Mit3F引物的核苷酸序列为序列表中序列5 ; 所述Mit3R引物的核苷酸序列为序列表中序列6 ; 所述Mit4F引物的核苷酸序列为序列表中序列7 ; 所述Mit4R引物的核苷酸序列为序列表中序列8。2. -种用于扩增线粒体基因组的PCR试剂，包括含有权利要求1中的所述引物对1的 PCR试剂1、含有权利要求1中的所述引物对2的PCR试剂2、含有权利要求1中的所述引物 对3的PCR试剂3和含有权利要求1中的所述引物对4的PCR试剂4。3. 含有权利要求1所述引物或含有权利要求2所述PCR试剂的试剂盒。4. 权利要求1所述引物、权利要求2所述PCR试剂在制备用于法医鉴定检材的产品中 的应用； 或权利要求1所述引物、权利要求2所述PCR试剂在制备用于法医鉴定检材的线粒体 基因组测序产品中的应用； 或权利要求1所述引物、权利要求2所述PCR试剂在制备用于线粒体基因组测序的产 品中的应用； 或权利要求1所述引物、权利要求2所述PCR试剂在线粒体基因组扩增中的应用； 或权利要求1所述引物、权利要求2所述PCR试剂在线粒体基因组测序中的应用； 或权利要求1所述引物、权利要求2所述PCR试剂在制备用于法医鉴定个体身份识别 产品中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述检材为无毛囊毛发或指甲或骨头或 牙齿或血斑或口腔脱落细胞。6. 根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述检材的样本量为如下： 所述无毛囊毛发的数量不少于1根、总长度不小于5cm ;所述无毛囊毛发的数量具体为 1根、长度为5-10cm ; 或所述指甲的表面积不小于〇. 2cm2 ;所述指甲的表面积具体为0. 2-0. 5cm2 ; 或所述血斑的直径不小于Icm ;所述血斑的直径具体为l_5cm。7. -种待测样本线粒体基因组DNA扩增方法，分别用权利要求1中的所述4个引物对 对线粒体基因组DNA进行PCR扩增。8. -种待测样本线粒体基因组DNA测序方法，包括如下步骤： 1) 分别用权利要求1中的所述4个引物对对线粒体基因组DNA进行PCR扩增，得到4 种PCR扩增产物； 2) 以所述4种PCR扩增产物构建待测序线粒体DNA文库； 3)测序所述待测序线粒体DNA文库，得到线粒体基因组DNA序列。9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述待测样本为无毛囊毛发或指甲 或骨头或血斑或口腔脱落细胞或牙齿。10. 根据权利要求7或8或9所述的方法，其特征在于： 所述待测样本的样本量为如下： 所述无毛囊毛发的数量不少于1根、总长度不小于5cm ;所述无毛囊毛发的数量具体为 1根、长度为5-10cm ; 或所述指甲的表面积不小于〇. 2cm2 ;所述指甲的表面积具体为0. 2-0. 5cm2 ; 或所述血斑的直径不小于lcm，所述血斑的直径具体为l_5cm。
【专利摘要】本发明公开了线粒体基因组检测方法及引物。本发明提供了一种用于法医鉴定检材的引物组，包括4个引物对；所述4个引物对分别为由Mit1F引物和Mit1R引物组成的引物对1、由Mit2F引物和Mit2R引物组成的引物对2、由Mit3F引物和Mit3R引物组成的引物对3以及由Mit4F引物和Mit4R引物组成的引物对4。本发明的方法检测出基因组量少的样本的线粒体DNA的全长序列，为法医学中微量检材的检测提供了重要的检测技术。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105087767
【申请号】CN201410482243
【发明人】崔路漫, 叶睿, 毕腾腾
【申请人】深圳华大基因科技有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年9月19日