梅咖斯托克斯氨基-三唑基-bodipy化合物及用于活神经元染色和人血清白蛋白fa1药物 ...的制作方法
【专利说明】梅咖斯托克斯氨基-三唑基-BODIPY化合物及用于活神经 元染色和人血清白蛋白FA1药物位点探测的应用
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2012年12月26日提交的美国临时申请No. 61/745,916的权益。
[0003] 上述申请的全部教导通过引用并入本文。
【背景技术】
[0004] 对了解化学和生物学中基本识别事件的需求已经做出了相当大的努力来开发化 学探针。由于高灵敏度、快速响应时间以及技术简单，荧光探针是用于分析传感和光学成像 两者的有吸引力的和通用的工具。然而，调节荧光探针与其靶标之间相互作用的机制往往 知之甚少；因此，使用理论计算来预测结构要求并设计新的探针的能力是有限的。最近，组 合的方法推进了荧光探针的生成和优化，尤其是用于在分子识别水平上仍然不确定的复杂 科学问题。利用常规的合成方法由市售结构单元得到已知荧光支架之组合策略的开发将使 得能够获取更广范围的荧光探针。
[0005] 基于BODIPY支架的荧光探针和分子成像探针的开发已被广泛利用，原因是其 显著的荧光特性（例如高的光稳定性、消光系数和量子产率，可调的激发光谱和发射光 谱）（1-7)以及容易转化成用于正电子发射断层扫描（PositronEmissionTomography， PET)成像的探针（8,9)。大多数对4,4_二氟-4-硼杂3a，4a二氮杂-s-吲哒省（4， 4_difluor〇-4-bora_3a，4a-diaza-s_indacene，B0DIPY)支架进行衍生化的方法都涉及液 相化学，这通常需要繁琐的纯化步骤（10)。在固相上进行BODIPY衍生化的尝试由于其在酸 性和碱性条件二者下的不稳定性而受阻（11)。
[0006] 需要开发基于可用的荧光支架（例如基于BODIPY的支架）以迅速获得新的化合 物文库的方法。此外，在这些文库中，需要开发对具有关键生物学功能的多种分析物具有选 择性和特异性的探针。
[0007]发明概述
[0008] 本发明是基于对用于检测人血清白蛋白的生物分析物的选择性荧光探针的发现 以及对使活神经元可视化具有选择性的荧光探针的相关发现。因此，在一个实施方案中，本 发明是一类新的氨基-三唑基BODIPY化合物。本发明的化合物可通过高通量合成的方法 迅速地合成并且包含3个可衍生的部分。本发明还涉及氨基-三唑基BODIPY化合物的合 成方法。具体而言，描述了固相合成法和溶液相合成法两者。在另一个实施方案中，本发明 是用于人血清白蛋白的荧光探针。在又一个实施方案中，本发明是用于原代神经元的选择 性染色的荧光染料。本发明还涉及用于检测生物流体样品中人血清白蛋白的方法。在一些 实施方案中，荧光强度的测量值与人血清白蛋白的浓度成比例。本文中还描述了用于使活 神经元可视化的方法，其可用于体外或体内应用。
[0009]附图简述
[0010] 通过下面如附图中举例说明的对本发明之示例性实施方案的更具体的描述，上述 内容将变得明显。
[0011] 图1示出了基于BODIPY的BDC和MK文库设计，并且还指出了结构和光谱性质之 间的关系。
[0012] 图2示出了代表性的氨基-三唑基-BODIPY的归一化吸光度和荧光发射光谱。 BDC-8(蓝色）：吸收Amax=473nm，发射Amax= 585nm;MK101-8(绿色）：吸收Amax=474nm， 发射Xmax= 563nm;MKHA374-48(黄色）：吸收X_= 468nm，X_= 557nm。还包括报道 的BODIPY的相应光谱（BD-27 ;红色）以用于比较：吸收Anax= 551nm，发射A_=568nm〇 还描述了BDC-8、MK101-8、MKHA374-48 和BD-27 的结构。
[0013] 图3示出了在室温（rt)下溶剂黏度对BDC-9 (IOOyM)的荧光强度的影响。在更 黏稠的醇类中，当在正辛醇和正己醇中时BDC-9的强度系统地增强。
[0014] 图4示出了BDC-9 (10yM)对IOmM的HEPES缓冲液（pH7. 4)中的16种不同浓度 (0.13、0.25、0.50、1.00mg/mL)的蛋白质的荧光响应（F);(人exc.:460nm，人eni.:575nm)。F0 为在HEPES缓冲液中BDC-9的荧光强度。数值表示为平均值（n= 4)。
[0015] 图5示出了在用磷酸盐缓冲液中的HSA的系列稀释液（I. 2X10 4至4mg/mL)孵育 后的BDC-9(10yM)的荧光光谱，Aex。:460nm。数值表示为平均值（n= 3)。
[0016] 图6示出了BDC-9 (10yM)在用HSA的系列稀释液孵育后的荧光发射响应；Aexc : 460nm，Aen :575nm;数值表示为平均值且误差条为标准差（n= 3) ;L0D= 0. 3yg/mL;线性 范围=0? 37 至 31yg/mL，R2= 0? 999。
[0017] 图7a和7b示出了BDC-9的物种选择性。具体而言，图7a示出了BDC-9 (IOyM)在 与各自的白蛋白的系列稀释液（1. 2X10 4至4mg/mL)相互作用后的荧光发射响应；AM。： 460nm，Aen :575nm;数值表示为平均值且误差条为标准差（n= 3)。图7b是BDC-9 (10yM) 与各自的白蛋白混合后的拍摄图像。用手持式UV灯在365nm处进行辐照。
[0018] 图8示出了与位点选择性HSA结合药物的竞争。用磷酸盐缓冲液中不同浓度 的药物（高达200yM)将HSA(无脂肪酸）（0.34mg/mL，5yM)预孵育2小时，之后添加 BDC-9(10yM)。F是在所指定的药物浓度下的荧光强度，F。是未添加药物的荧光强度； 入exc.:460nm，Aen :575nm;数值表示为平均值且误差条为标准差（n= 3) 〇
[0019] 图9示出了工作作图分析（jobplotanalysis)。具体而言，在磷酸盐缓冲液中将 BDC-9与HSA(无脂肪酸）以不同的比例混合，同时保持总浓度在20yM;Aexc :460nm，人eni.: 575nm;数值表示为平均值且误差条为标准差（n= 3)。
[0020] 图10是显示在用磷酸盐缓冲液中的HSA(IOyM)孵育后BDC-9的系列稀释液 (0_、0.47_至60_)的荧光发射的荧光光谱；人_:46011111，1 111:57511111;数值表示为 平均值且误差条为标准差（n= 3) ;KD= 12. 7±0. 4yM(-个位点特异性结合模型）。
[0021] 图11示出了尿样中BDC-9的荧光响应。将HSA(0至lmg/mL)添加至磷酸盐缓冲液 (pH= 7. 3)中的来自健康个体的10%尿液中。在10yM浓度时添加BDC-9 ;Xexc :460nm， 入eni.:575nm;数值表示为平均值且误差条为标准差（n= 3);线性回归：R2= 0. 998。
[0022] 图 12a示出了MKCA101-3(左），MKHA101-3(中）和MKAA101-3(右）染色的混合 原代神经细胞群的流式细胞术图，示出了基于化合物荧光从主群体中分离出神经元群（约 2G多至约3. 5G)。在各光谱中约0至约IG示出了未染色的对照。
[0023] 图12b是来自已分化的神经球的神经元的图像。MKHA101-3相对于MKCA101-3显 示出显著提高的特异性。
[0024] 图13示出了MKHA101-3及其衍生物的化学结构。
[0025] 图14示出了MKHA374-48亲和类似物的化学结构。
[0026] 图15示出了用于识别神经元特异性探针MKHA101-3的原代神经元筛选的示意图。 左边的图像显示明亮染色的神经元，与它们的其他的胶质细胞对照物截然相反。
[0027] 图 16a示出了MKHA101_3(左）和MKHA374_48/Neu0(右）的结构。
[0028] 图16b是MKHAlO1-3 (左）和NeuO(右）染色的混合活神经元细胞群的流式细胞 图，示出了基于化合物荧光从主群体中分离出的神经元群。
[0029] 图17示出了在放大100倍，比例尺为20ym时，MKHA101-3染色的神经元的活细胞 共聚焦图像以及混合的原代神经元细胞培养物的活细胞化合物染色和免疫染色。用500nM 的MKHA101-3 (绿色）对细胞进行染色并在放大10倍时进行成像，之后用4%PFA固定。然 后，用〇? 1 %的Triton-X进行透化处理并用GFAP(红色）和神经元（绿色）进行免疫染色。
[0030] 图18示出了活细胞化合物染色和混合的原代神经细胞培养物的免疫染色。用 500nM的NeuO(绿色）对细胞进行染色并在放大10倍时进行成像，之后用4%PFA固定。然 后，用0.1 %的Triton-X进行透化处理并用(6-111微管蛋白（Tuji，黄色），GFAP(红色） 和04进行免疫染色。
[0031] 图19a示出了来自用500nM的NeuO染色的来自新生和成年小鼠脑之混合原代神 经细胞的流式细胞术散点图。
[0032] 图19b是示出了从分选自新生和成年脑的整体（未分选的）、明亮级分和暗淡级分 之细胞所测量的(6-111微管蛋白的基因表达的柱状图。
[0033] 图19c示出了用500nM的MKHA101-3染色的混合原代神经元细胞的流式细胞术散 点图。右边的直方图示出了化合物阳性的细胞占整个细胞群体的20%。
[0034] 图20a示出了从化合物阳性级分再培养的具有神经元形态的活细胞。
[0035] 图20b和20c示出了认为对P-III微管蛋白（绿色），核染色（蓝色）为阳性的 免疫染色细胞；比例尺：50ym。
[0036] 图21是显示经MKHA101-3染色的混合原代神经细胞的整体（未分选的）、明亮级 分和暗淡级分的P-III微管蛋白的表达的柱状图。明亮级分与整体和暗淡级分相比，明显 地显示出了 (6-111微管蛋白的更高表达。
[0037] 图22是显示神经元生存力的柱状图。通过优先黏附到聚D-赖氨酸涂层上来分离 来自P1-3小鼠幼仔的原代神经元。将它们熟化5天，之后以规定的浓度添加化合物，经历 24个小时。根据制造商的说明使用MTS测定（Promega)来评估生存力。
[0038] 图23,在上部图形中，示出了用500nM的NeuO染色以及使用时间推移成像进行成 像以使神经元树突的形成可视化的DIVl神经元培养物的视频照片。图23的下部图形示出 了来自神经前体细胞的神经元发育/分化的时间推移成像。可以看出明亮的NeuO染色的 神经元从球体的内部迀移出来。
[0039] 图24描述了设计用于共价地结合神经元靶标以及亲和富集的亲和分子。
[0040] 图25描述了使用AffiNeu07和AffiNeu05系列进行亲和富集的代表性方案。
[0041] 图26描述了NeuO-PET，其可在一些实施方案中用于PET成像。
[0042] 图27描述了用于活神经元的NeuR和NeuIR红色荧光探针。
[0043] 图28示出了用MKHA101-3染色的胚胎脑切片和在放大10倍时的成像。捕捉的图 像显示了染料特别地加亮了具有长树枝状突起的细胞，使人联想起神经元染色。
[0044] 发明详述
[0045] 本发明的示例性实施方案描述如下。
[0046] 公开了 一类新的三唑衍生的4,4-二氟-4-硼杂-3a，4a_二氮杂-S-吲哒省 (BODIPY)化合物。这类化合物包括两种新的荧光探针，包括首次独立地与脂肪酸位点1结 合的人血清白蛋白（HSA)探针，并且还包括特异性地且独特地对原代神经元进行染色的神 经元细胞探针。
[0047] 文库设计-梅咖斯托克斯（MegaStokes)氨基-三唑基-BODIPY化合物
[0048] 最近报道了采用Knoevenagel反应和保持荧光团完整性的温和的酸性裂解条 件的第一种固相BODIPY文库（12)。本发明涉及采用铜-催化的叠氮-炔环加成反应 (Copper-CatalyzedAzide-AlkyneCycloaddition，CuAAC)来制备氨基-三唑基-BODIPY 化合物（BDC和MK)以及它们相应的乙酰基（AC)、氯乙酰基（CA)和羟乙酰基（HA)衍生物的 第一文库（13)的替代的固相组合衍生策略。值得注意的是，在BODIPY核心的位置3和位置 5处引入与氨基取代基配对的三唑部分导致了荧光化合物非常大的斯托克斯位移（74nm至 160nm)。最小化其激发光谱和发射光谱之间的重叠的梅咖斯托克斯染料提供了超过其他荧 光团的增强的灵敏度和作为用于体外应用的传感器的特殊潜力。尽管其他荧光结构（例如 香豆素，苯乙烯基）已被修饰以增强其斯托克斯位移，本文中所公开的BDC和MK文库的化 合物代表了首次系统地产生的基于BODIPY支架的梅咖斯托克斯染料。此外，这些氨基-三 唑基-BODIPY化合物显示出对环境变化的敏感性。本文中鉴定的是表现为环境敏感性荧光 开启型传感器的化合物。这样的BODIPY核心结构的固有荧光在特定的环境中被回收。
[0049] 设计，合成和光物理学性质
[0050] 由于CuAAC的高效率、稳健性以及其在温和反应条件中的成功，其对于组合的目 的而言是非常有利的（13,14)。所得的三唑环是化学上稳定的且在荧光核心内的某些位置 上，可调节所得到的荧光衍生物的光谱波长（15，16)。文献调查显示，在BODIPY支架位置3 和位置5处引入供电子基和吸电子基可有效地改变其斯托克斯位移（17-19)。基于这些报 告，设计三官能的BODIPY苯胺（4,方案1)来用于BODIPY文库的合成。该支架具有3个用 于多样化的点，位置3和位置5处的两个亲电子位点，其可被例如分别通过CuAAC和亲核取 代修饰（20-24)，和在内消旋位置的一个苯胺位点，其可被乙酰化修饰。
[0051] 开发了两种用于合成氨基-三唑基BODIPY化合物的方法，S卩，固相法和溶液相法。 溶液相法允许较大规模的生产BODIPY化合物，而固相法提供了大的化合物文库的实际路 线。这两种方法都详述如下。
[0052] 固相合成
[0053] 固相法允许小规模地迅速合成较大的氨基-三唑基BODIPY化合物的文库。4上的 苯胺官能团能够将支架负载到氯代三苯甲基氯聚苯乙烯（CTC-PS)树脂上。随后在弱酸性 的条件下的切割保持了荧光团的完整性（方案1) (12)。在某些实施方案中，可使用其他的 氯化的或溴化的固体支持物支架。
[0054] 在一个示例性实施方案中，4的合成由四个步骤组成，具有37%的总产率。按照报 道的方法很容易地由对硝基苯甲醛和吡咯制备1 (25, 26)。用N-氯代琥珀酰亚胺（NCS)进 行氯化，随后用2, 3-二氯-5,6-二氛基-1，4-苯醌（DDQ)进行氧化从而提供2,随后用BF3. OEtJ# 2进行处理以得到高度稳定的BODIPY类似物3 (26, 27)。用活性铁进行还原提供了 定量产率的4。然后用标准的偶联条件将苯胺负载到CTC-PS树脂上。用叠氮化钠处理产生 了双取代的叠氮化物中间体，在所述中间体上，首先通过胺结构单元的单取代（方案3)以 及随后通过炔结构单元的CuAAC(方案4)引入多样性。最后用CH2Cl2中的0. 5%三氟乙酸 (TFA)切割产生BDC和MK文库的相应氨基三唑基BODIPY化合物，在最少的纯化步骤中具 有95%的平均纯度。这些化合物具有游离的苯胺，其可进一步经酰基氯结构单元乙酰化以 添加官能性，生成相应的乙酰基（AC)、氯乙酰基（CA)、乙酰氧基乙酰氯（AA)和羟基乙酰基 (HA)衍生物（方案5)。在某些实施方案中，CA标签对于蛋白标记是有用的，而与一些MK化 合物偶联的HA标签具有对原代神经元的特定荧光响应。在某些实施方案中，AA标签以及 其他类似的衍生物可以是有用的对完整活细胞具有改进渗透性的疏水性HA前体。随后通 过细胞酯酶的水解释放活性HA化合物。
[0055] 方案1.氨基-三唑基BODIPY化合物的固相合成
[0056]
[0057]试剂和条件：（a)吡咯，TFA，室温，3小时；(b)NCS，干燥的THF，-78 °C至室温， 3小时；（c)DDQ，干燥的CH2Cl2,室温，1小时；（d)BF3OEt2,干燥的CH2Cl2,室温，2小时；（e) 活性Fe，CH3OH:CH3COOH(K) : 1)，回流，15 分钟；（f)CTC-PS树脂，DIEA，CH2C12/DMF， 室温，24小时；（g)NaN3,DMF，室温，30分钟；(h)DMF:哌啶（4 : 1)，室温，45分钟；⑴ DMF:R2R3NH(4 : 1)，室温，1 小时；（j)R1-C三CH，CuI，抗坏血酸，室温，30 分钟；（k)CH2Cl2 中 0. 5 % 的TFA; (I)R4COCl，饱和NaHCO3,室温，10 分钟；(m)CH3C00CH2C0C1，饱和NaHCO3，室 温，10分钟；(n)K2CO3,MeOH，H2O,室温，1小时。化合物5中的暗色球体代表氯代三苯甲基聚 苯乙烯树脂。
[0058] 溶液相合成
[0059] 在一些作为替代的实施方案中，将产生BDC和MK化合物的溶液相法用于染料的大 规模合成（方案2)。在一个示例性实施方案中，如在固相法中所描述的来合成化合物1、2 和3。随后将氨基和三唑基官能团添加到3上。首先用二甲基甲酰胺（DMF)溶剂中约2. 2 当量的叠氮化钠处理化合物3以产生双取代的叠氮化物中间体。紧接其后是用1当量未经 纯化的相应的胺结构单元进行亲核取代（方案3)。反应完成后，除去DMF，并且将粗制混合 物重新溶解于叔丁醇溶剂中，之后用合适的炔结构单元进行CuAAC(方案4)。最后用活性铁 对硝基苯部分进行还原，得到相应的BDC和MK化合物，任选地使用在固相合成中描述的步 骤对其进一步乙酰化以产生相应的乙酰基（AC)、氯乙酰基（CA)、乙酰氧基乙酰氯（AA)和羟 乙酰基（HA)衍生物（方案5)。
[0060] 方案2.氨基-三唑基BODIPY化合物的溶液相合成。
[0061]
[0062] 试剂和条件：（a)吡咯，TFA，室温，3小时；(b)NCS，干燥的THF，-78 °C至室温， 3小时；（c)DDQ，干燥的CH2Cl2,室温，1小时；（d)BF3OEt