1^)、饱和似110) 3(1\151^)、饱和盐水（1\151^)洗涤 并经无水Na2SO4干燥。蒸发有机萃取物以得到作为橙色固体的相应的BDCAC、BDCCA、BDCXA、 MKAC、MKCA或MKXA化合物（一般约6mg，> 90%产率）。表3、4、6和7具有特定的化学结 构和详细的表征数据。
[0173] 制备MKHA化合物的一般方法：
[0174] 向在Q12C12(L5mL)中各MK化合物（一般约6mg，0?Ollmmol)的溶液添加6滴饱和 NaHOVK溶液并冷却至(TC。在1分钟内分批添加乙酰氧基乙酰氯（10yL，0.IImmol)，将所 得混合物在室温下搅拌并通过分析型TLC进行监测。完成后，蒸发CH2Cl2并将混合物重新溶 解于MeOH(I. 5mL)中。添加6滴饱和Na2CO3水溶液，将反应混合物在室温下进行搅拌并通过 分析型TLC进行监测。用CH2Cl2 (15mL)稀释反应，用水（2X15mL)、饱和NaHCO3(IX15mL)、 饱和盐水（IX15mL)洗涤并经无水Na2SO4干燥。蒸发有机萃取物以得到作为橙色固体的相 应的MKHA化合物（一般约6mg，> 90%产率）。表8具有化学结构和详细的表征数据。
[0175] 用于特定化合物的制备方法和表征数据：
[0176] 2,2' -((4-硝基苯基）亚甲基）双（1H-吡咯）（1)。向在吡咯（10mL，144mM)中 的4-硝基苯甲醛（I. 0g，6. 6mmol)溶液添加TFA(0. 51mL，0. 66mmol)并在室温下搅拌3小 时。在真空中将混合物浓缩，并在硅胶上（己烷：EtOAc，4 : 1)通过快速柱色谱法进行纯 化以得到作为亮黄色固体的l(1.63g，6. 10臟〇1，92%产率）。
[0177] 1HNMR(300MHz，CDCl3) :S8. 17(d，J= 8. 7Hz，2H)，7. 99(br.s，2H)，7. 36(d，J =8.7Hz，2H)，7.99(br.s，2H)，6.75(d，J= 5.8Hz，2H)，6.18(dd，J= 5.8,2.9Hz，2H)， 5.87(br.s，2H)，5.58(s，lH);13CNMR(125MHz，CDC13):S= 144.7，144.2，132.2，130.5， 123. 8,118. 0,108. 5,107. 7,45. 9 ;MS(ESI) :m/z[M+H] + = 268.I.
[0178] 1，I'-二氯-5-(4-硝基苯基）二吡咯甲川（2)。在_78°(：的N2气氛下将在无 水THF(35mL)中的1(1.lg，4.lmmol)的溶液搅拌15分钟。使用均压漏斗逐滴添加无水 THF(35mL)中的N-氯代琥珀酰亚胺（1.4g，10. 3mmol)并将所得的混合物在室温下搅拌3 小时。完成后，添加2,3-二氯-5,6-二氰基-对苯醌（1.12 8,4.92臟〇1)并将反应混合 物在室温下再搅拌2个小时。在真空中除去THF并用水（20mL)稀释得到的混合物并用 CH2Cl2 (3X70mL)进行萃取。将合并的有机萃取物用饱和盐水洗涤，经无水似2304干燥并在 真空中除去溶剂。在硅胶上（己烷：EtOAc，10 : 1)通过快速柱色谱法将所得的残余物进 行纯化以得到作为深橙色固体的2(0. 78g，2. 3mmol，57%产率）。
[0179]1H NMR(300MHz，CDCl3):S= 8.32(d，J=4. 3Hz，2H)，7. 62(d，J=4. 3Hz， 2H)，6.41(d，J = 2.1Hz，2H)，6.29(d，J = 2.1Hz，2H) ;13C NMR(125MHz，CDCl3) = 164. 0,147. 1，146. 6,146. 1，136. 0,130. 8,127. 3,123. 8,121. 8,116. 3,112. 1，32. 7,14. 8 ; MS(ESI)：m/z[M+H]+= 334.0.
[0180] 3,5-二氯-8-(4'-硝基苯基）-4,4-二氟-4-硼杂-3&，4 &二氮杂-8-吲哒 省（3)。向在无水〇12(：12(7〇1^)中的2(1.(^，2.97臟〇1)的溶液添加11二异丙基乙胺 (3.lmL，17. 8mmol)，于(TC搅拌10分钟。逐滴添加三氟化硼乙醚合物（2. 2mL，17. 8mmol)， 在室温下将所得混合物搅拌2小时。完成后，在真空中除去溶剂并且在硅胶上（己 烷：EtOAc:MeOH，10 : 1 : 0.1)通过快速柱色谱法将所得的残余物进行纯化以得到作 为深红紫色固体的3 (0. 81g，2. 14mmol，72%产量）。
[0181] H NMR(300MHz，CDCl3) : S = 8. 39(d，J = 4. 4Hz，2H)，7. 69(d，J = 4. 4Hz， 2H)，6.75(d，J = 2.2Hz，2H)，6.48(d，J = 2.2Hz，2H) ;13C NMR(125MHz，CDCl3) = 162. 4,148. 4,147. 1，132. 0,125. 3,126. 8,124. 5,123. 8,127. 3,120. 8,114. 9, 111. 3 ;19F NMR(282MHz，CDCl3) : S = -72. 12(q，J = 30Hz) ;MS(ESI) :m/z[M+H] + = 382. 9.
[0182] 3, 5-二氯-8-(4氨基苯基）-4,4_ 二氟-4-硼杂 _3a，4a-二氮杂-s-吲哒 省（4)。在IM的HCl中将铁粉（I. 46g，26. 2mM)的混悬液活化I分钟，用无水EtOH润洗并 按原样使用。向在Et0H(80mL)和乙酸（8mL)中3(500mg，1.3mm〇l)的溶液中添加活化的 铁并回流。通过TLC对反应混合物进行监测。完成后，除去铁并在真空中蒸发溶剂。用水 稀释残余物，并用CH2Cl2(3X70mL)进行萃取。用饱和Na2CO3、饱和盐水洗涤合并的有机萃 取物，经无水Na2SO4干燥并在真空中除去溶剂。在硅胶上（己烷：EtOAc:MeOH:NH3: 6 : 3 : 1 : 0.05)通过快速柱色谱法将所得的残余物进行纯化以得到作为暗红色固体的 4(197mg，0. 56mmol，98%产率）。
[0183] 1HMffi(300MHz，CDCl3) :S= 7. 33(dt，J= 8. 5,2. 6Hz，2H)，6. 92(d，J= 3.8Hz，2H)，6.76(dt，J= 8.5,2.6Hz，2H)，6.42(d，J= 3.8Hz，2H)，4.11(br.s，2H);13C NMR(125MHz，CDCl3) :S= 162. 4,147. 6,132. 0,128. 7,125. 2, 26. 9,124. 5,120. 8,114. 9， 111.3;19FNMR(282MHz，CDCl3) :S= -72. 05(q，J= 25Hz) !HRMS(C15H11BCl2F2N3):算得 [M+H]+:352. 0386,实测[M+H] +:352. 0215.
[0184] 10-(4-氨基苯基）-5, 5-二氟-7-(4-苯基-1H-1，2, 3-三唑-I-基）-3-(哌 啶-1-基）-5H-二吡咯并[l，2-c:2'，1' -f][l，3,2]二氮杂硼环己烯-4-正离子-5-负 离子出0(：-9):橙色固体（1711^，0.032臟〇1，72%产率）；
[0185] 1H NMR(500MHz，CDCl3) : S = 8. 56(s，1H)，7. 94(d，J = 6. 9Hz，2H)，7. 45(t，J = 7. 6，Hz，2H)，7. 35(t，J = 7. 6Hz，1H)，7. 27(d，8. 2Hz，2H)，6. 94(d，J = 5. 7Hz，1H)，6. 80(d， J = 8. 2Hz，2H)，6. 62(d，J = 3. 8Hz，1H)，6. 42(d，J = 3. 8Hz，1H)，6. 32(d，J = 5. 1Hz，1H)， 5.30(s，lH)，3.78-3.88(m，4H)，1.64-1.80(m，6H)，1.26(br.s，2H) ;13C NMR(75MHz，CDCl3): S = 162. 2,146. 7,136. 0,135. 7,134. 9,131. 8,131. 3,131. 0,130. 8,129. 6,128. 7,127. 9， 126. 0,125. 0,122. 4,122. 3,116. 9, 115. 4,115. 0,114. 9,109. 7,53. 4, 52. 0,29. 7,26. 3， 24. 0 ;19F NMR(282MHz，CDC13) : S = -55. 82(q，J = 34Hz) !HRMS(C28H27BF2N7):算得[M+H]+: 510. 2384,实测[M+H]+:510. 2399.
[0186] 7-(苄氨基）-5,5_二氟-10-(4-(2-羟基乙酰氨基）苯基）-3-(4-丙基-1H-1， 2,3_三唑-1-基）-5H-二吡咯并[l，2-c:2'，广-f][l，3,2]二氮杂硼环己烯-4-正离 子-5_负离子〇\0(撤374-48):橙色固体（1511^，0.027臟〇1，61%产率）；
[0187] 1H NMR(500MHz，CDCl3) : S = 8. 91(s，1H)，8. 15(s，1H)，7. 71(d，J = 8. 2Hz，2H)， 7. 33-7. 39 (m，5H)，7. 27-7. 30 (m，3H)，6. 95 (d，J = 5. 0Hz，1H)，6. 74 (br. s，1H)，6. 38 (s， 2H)，6. 20(d，J = 4. 4Hz，1H)，4. 60(d，J = 6. 3Hz，2H)，4. 30(s，2H)，2. 80(t，J = 7. 6Hz，2H)， I. 80(qt，J = 7. 6Hz，2H)，I. 03(t，J = 7. 6Hz，3H) ;13C NMR(125MHz，CDCl3) : S = 170. 8， 162. 5, 139. 0, 136. 9, 136. 1，133. 9, 132. 4, 132. 0, 131. 8, 131. 0, 129. 2, 128. 9, 128. 4， 127. 6,126. 8,119. 6,119. 0,112. 5,109. 5,62. 6,48. 4,28. 7,22. 4,13. 7 ;19F NMR(282MHz， CDCl3) : S = -68. 29 (q，J = 33Hz) !HRMS(C29H28BF2N7O2):算得[M+H]+:556. 2444，实测 [M+H]+：556. 2461.
[0188]表2.BDC化合物文库的化学结构和表征数据。
[0189]
[0271] 实施例2.氨基-三晔基-BODIPY化合物作为荧光分子转子的分析。
[0272] 在具有覆盖一定范围的黏度的类似极性的不同溶剂中分析化合物（BDC-9)的荧 光光谱。如图3所示，观察到了荧光强度和黏度之间的强相关性。增大的溶剂黏度降低了 BODIPY核心的位置3和位置5的键旋转，不受理论的限制，这最小化了非辐射能量的损失并 导致更高的量子产率（24)。这一结果证实了氨基-三唑基-BODIPY作为荧光分子转子的潜 力。
[0273] 实施例3.诜择件HSA荧光探针的鉴宙
[0274] 材料和方法
[0275] 除非另有说明，否则在室温下在磷酸盐缓冲液（pH7. 3,1 %DMS0)中制备BDC-9与 HSA的混合物，在孵育2小时后进行荧光测量。
[0276] 体外荧光筛选
[0277] 在含1 %DMSO的IOmMpH7. 4的HEPES缓冲液中对氨基-三唑基-BODIPY(10yM) 进行筛选。使用SpectraMaxM2酶标仪在384孔板中测定焚光强度。在每个化合物的激发 范围内提供激发并且从超出激发波长至少30nm处开始获得发射光谱。所有的分析物均在 四个系列的浓度下进行测试。
[0278] 检查了BDC、BDCAC和BDCCA对分为九个不同的集合（即pH标准物、黏性溶液、遗 传大分子、肽、金属离子、氧化还原分子、核酸、蛋白质和其他代谢物）的84种生物相关的分 析物的荧光响应。氨基-三唑基-BODIPY化合物在与某些特定的蛋白质孵育后显示出显著 的荧光增强。作为一个代表性的实例，相对于其他蛋白质和分析物，化合物BDC-9显示了对 人血清白蛋白（HSA)的显著选择性（图4)。
[0279] 除了其高选择性，BDC-9显示了在与HSA结合后荧光220倍的显著增强（图5)。证 明BDC-9的响应在0. 37至31yg/mL的动态范围内呈线性，并且确定了HSA的检测限（S/N =3)为 0.3yg/mL(图 6)。
[0280] 研究了BDC-9对来自不同物种的血清白蛋白的选择性。血清白蛋白代表其一级 序列在跨跃多种物种中具有高度相似性的蛋白质家族（约75%同源性）（34,39,40,62)。 然而，发现一些白蛋白的配体显示物种依赖性结合差异且物种选择性探针的开发可能对 白蛋白结合位点的结构研究有用（63-67)。评估了BDC-9对来自大鼠（RSA)、猪（PSA)、兔 (RbSA)、绵羊（SSA)和牛（BSA)的系列浓度的血清白蛋白的荧光响应。如在图7a-b中所示， BDC-9显示了对HSA的显著选择性，对其他物种具有微小的响应（68,69)。
[0281] 实施例4.BDC-9对HSA的结合分析
[0282] 研究了BDC-9的结合特性。HSA包含至少九个结合位点（34-38)，其中已知脂肪 酸（FA)位点1、3和4 (Sudlow位点II)，5、6和7 (Sudlow位点I)对药物化合物具有亲和力 (31，39-44)。最近的报告表明了HSA上对应于脂肪酸1位点（FAl)的第三主要的药物结 合位点的重要性（70)。为了验证特异性结合并确定HSA中BDC-9的结合位点，使用与各自 位点结合的药物（例如，氯高铁血红素（FA1位点）（71，72)、丹磺酰基-L-正缬氨酸（FA3/4 位点）（73)、丙泊酚（FA3/4和FA5位点）（35)、布洛芬（FA3/4和FA6位点）（74)和华法林 (FA7位点）（74))进行竞争测试（75)。
[0283] 如图8中所示，仅与血红素的竞争才引起了BDC-9荧光响应的显著减小，而与所有 其他药物的竞争没有影响BDC-9的荧光。这些观察结果清楚地表明，BDC-9的环境启动响 应是由于其与HSA的FAl位点（血红素位点）的结合。已经有一些与FA3/4 (48,49, 73)、 FA6 (51)和FA7 (54, 55, 76)位点结合的荧光染料的报道。本发明代表了与FAl位点结合的 首次已知的经实验证明的荧光染料（76)，其中结合不依赖于与结合脂质的接触（72)。因 此，BDC-9是用于检查HSA上的亚铁血红素区的有价值的探针。
[0284] 进行工作作图分析以确定通过BDC-9和HSA形成的复合物的化学计量，并确认来 自位点选择性研究的结果。BDC-9的荧光响应在BDC-9 :HSA为I: 1比例时达到峰值，这 表明BDC-9主要在蛋白质的一个位点上进行结合（图9) (77, 78)。
[0285] BDC-9与HSA的解离常数的确定。
[0286] 用HSA(K)yM)对系列浓度的BDC-9(0. 47至60yM)进行滴定并在575nm(Aexc = 460nm)处测定荧光强度。使用以下等式确定结合的BDC-9在每个浓度下的荧光强度：
[0287]
[0288] 其中，F和F。是分别具有和不具有HSA之给定浓度的BDC-9的荧光强度。F是 相同浓度下完全结合的BDC-9的荧光强度。
[0289] 将一点结合模型拟合为HSA(0. 67mg/mL)与系列浓度的BDC-9的滴定，并将BDC-9 的解离常数（Kd)确定为12. 7±0. 4yM(图10)。
[0290] 实施例5.应用BDC-9以量化尿液中的HSA
[0291] 为了检查BDC-9在复杂基质中的选择性和灵敏度，利用BDC-9量化尿液样品中HSA 的量。微量白蛋白尿（其涉及15至40yg/mL的白蛋白排泄率（80,81))是一种公知的心血 管风险标记物以及肝和肾疾病的指示（32, 33)。分析了掺入不同量（高达lmg/mL)的HSA 的尿液中BDC-9的荧光响应。在BDC-9的荧光响应与在临床上显著的范围内的HSA量之间 存在极好的线性相关性（图11)，这证明BDC-9量化尿样中HSA水平的潜力。
[0292] 实施例6.MKHA和NeuO神经细朐探针的发现
[0293] 在对第2代氨基-三唑基-BODIPY化合物（MK、MKAC、MKCA)的基于细胞之初步筛 选中，MKCA化合物显示出对原代神经元的一些弱的响应。随后转变成MKHA衍生物，一般显 著地改善了对原代神经元的荧光响应（图12)。对MKAA的酯化（以及可能的其他酯）提高 了对完整活细胞的渗透性，同时保持了染色的特异性（图12)。乙酰化的MKAA在跨过活细 胞膜后，通过细胞酯酶经历迅速的水解生成了负责荧光响应的活性MKHA化合物。图13和 14显示了已经被合成并对原代神经元染色进行了测试的示例性MKHA化合