高密度细胞存储方法
【专利说明】高密度细胞存储方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年3月15日递交的美国临时申请No. 61/793,021的优先权，将 其内容通过提述以其整体并入本文用于全部用途。
【背景技术】
[0003] 常规细胞存储（cellbanking)广泛用于保存冷冻的、特征性的细胞，这些细 胞可能被解冻用于多种应用，包括治疗相关蛋白的生产。通常而言，将冷冻保存的储液 (cryopreservedstock)以较低的密度保存，或者离心以生成更高密度的等分试样用于储 存。较低密度的储液不允许有效接种大体积的培养物，而基于离心的浓缩方法对于细胞可 以是非常有破坏性的（在冷冻保存过程期间细胞会变得更加脆弱）。因此，需要改进的细胞 存储方法。
【发明内容】
[0004] 本公开提供了改进的创建细胞库的方法。在某些方面，本发明的细胞存储方法采 用灌注培养技术和细胞的非离心浓缩以允许以出乎意料高的细胞密度进行冷冻保存，同时 保持出色的细胞活力以供稍后在生产细胞培养物中使用。
[0005] 因此，在一方面，本发明提供用于产生高密度冷冻细胞库的非离心方法，所述方法 包括：a)在灌注生物反应器中培养细胞，其中所述生物反应器与细胞保留系统偶联；b)以 非离心的方式浓缩所述细胞以产生浓缩的细胞群体；和c)冷冻保存浓缩的细胞群体以产 生高密度冷冻细胞库。
[0006] 在一个实施方案中，所述细胞保留系统包含交替切向流过滤系统（alternating tangentialflowfiltrationsystem)，所述交替切向流过滤系统包含过滤器。在另一个 实施方案中，所述过滤器具有至少〇. 3m2的表面积。在另一个实施方案中，所述过滤器具有 约0. 5至约I.Om2的表面积。在另一个实施方案中，所述过滤器具有约0. 7至约0.Sm2的表 面积。在另一个实施方案中，所述过滤器具有约2.0至约3.Om2的表面积。在另一个实施 方案中，所述过滤器具有约4至约5m2的表面积。
[0007] 在一个实施方案中，所述过滤器具有约0. 2ym的孔径。
[0008] 在一个实施方案中，所述浓缩的细胞群体具有至少约Ix10~8个细胞/mL的细胞 密度。
[0009] 在一个实施方案中，所述浓缩的细胞群体具有约Ix10~8个细胞/mL的细胞密度。
[0010] 在一个实施方案中，所述冷冻保存包括以约5 %至约10 %体积/体积的终浓度将 DMSO添加至浓缩的细胞群体。在另一个实施方案中，所述冷冻保存包括将至少一部分浓缩 的细胞群体冷冻在适合于在冷冻保存条件下储存的容器中。
[0011] 在一个实施方案中，所述容器是小瓶。在一个实施方案中，所述容器具有至少2mL 的体积。在一个实施方案中，所述容器具有约5mL的体积。
[0012] 在一个实施方案中，所述高密度冷冻细胞库包含约4. 5xKT8个细胞。
[0013] 在一个实施方案中，所述容器是冷冻袋。在另一个实施方案中，冷冻袋具有约5至 约150mL的体积。
[0014] 在一个实施方案中，所述高密度冷冻细胞库具有约lxKT8个细胞/mL的细胞密 度。
[0015] 在一个实施方案中，所述灌注生物反应器中的灌注速率为至少约0.2nL/细胞/ 天。
[0016] 在一个实施方案中，所述灌注生物反应器细胞培养物具有约7的pH和至少约40% 的溶解氧浓度。
[0017] 在一个实施方案中，所述生物反应器是柔性袋式生物反应器。在另一个实施方案 中，所述柔性袋式生物反应器具有IOL的体积。在另一个实施方案中，所述柔性袋式生物反 应器具有至少20L的体积。在另一个实施方案中，所述柔性袋式生物反应器进一步包含至 少一个汲取管（diptube)。
[0018] 在一个实施方案中，所述高密度冷冻细胞库具有至少60%的解冻后活力。在另一 个实施方案中，所述高密度冷冻细胞库具有至少90 %的解冻后活力。在另一个实施方案中， 所述高密度冷冻细胞库具有至少95 %的解冻后活力。
[0019] 在一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，所述哺乳动 物细胞选自下组：CHO、CHO-DBXl1、CH0-DG44、CHO-S、CHO-Kl、Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、 HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NSO、CRL7030、HsS78Bst细胞、 PER.C6、SP2/0-Agl4和杂交瘤细胞。
[0020] 在一个实施方案中，所述细胞是经转染的细胞。
[0021] 在一个方面，本发明提供用于产生高密度冷冻细胞库的非离心方法，所述方法包 括：a)在灌注生物反应器中培养细胞，所述灌注生物反应器偶联至交替切向流过滤系统， 其中所述生物反应器包含柔性袋式生物反应器，并且其中所述过滤器具有至少〇. 3m2的过 滤器表面积，和具有至少50kDa的MffCO尺寸的过滤器；b)使用交替切向流过滤系统以非离 心的方式浓缩所述细胞，以产生具有约lxKT8个细胞/mL的密度的浓缩的细胞群体；c) 冷冻保存浓缩的细胞群体以产生高密度冷冻细胞库，其中所述冷冻保存包括以约5%至约 10 %体积/体积的终浓度将DMSO添加至浓缩的细胞群体；并且其中所述高密度冷冻细胞库 具有约lxKT8个细胞/mL的细胞密度。
[0022] 在一个实施方案中，所述培养物的pH和DO通过自动化方法控制。
[0023] 在一个实施方案中，所述培养物的pH和DO通过非自动化方法控制。在另一个实施 方案中，所述PH和DO通过以下中的任何一种或多种控制：调节引入至所述培养物中的气体 的混合物，调节生物反应器的摇动速率（rockrate)，或调节生物反应器的摇动角度（rock angle)〇
[0024] 在一个实施方案中，所述生物反应器以15rpm并以8°的摇动角度摇动。
[0025] 因此，在一个方面，本发明提供用于产生高密度冷冻细胞库的非离心方法，所述方 法包括：a)在灌注生物反应器中培养细胞，其中将所述生物反应器偶联至细胞保留系统； b)以非离心的方式浓缩所述细胞以产生浓缩的细胞群体；和c)冷冻保存浓缩的细胞群体 以产生高密度冷冻细胞库。
[0026] 在一个实施方案中，所述细胞保留系统包含交替切向流过滤系统，所述交替切向 流过滤系统包含过滤器。在另一个实施方案中，所述过滤器具有至少0.3m2的表面积。在 另一个实施方案中，所述过滤器具有约〇. 5m2至约I.Om2的表面积。在另一个实施方案中， 所述过滤器具有约0. 7至约0.Sm2的表面积。在另一个实施方案中，所述过滤器具有约2. 0 至约3.Om2的表面积。在另一个实施方案中，所述过滤器具有约4至约5m2的表面积。
[0027] 在一个实施方案中，所述过滤器约0. 2ym的孔径。
[0028] 在一个实施方案中，所述浓缩的细胞群体具有至少约I.Ix1(T8个细胞/mL的细 胞密度。
[0029] 在一个实施方案中，所述浓缩的细胞群体具有约I.Ix1(T8个细胞/mL的细胞密 度。
[0030] 在一个实施方案中，所述冷冻保存包括以约5%至约10 %体积/体积（vol/vol) 的终浓度将DMSO添加至浓缩的细胞群体。在另一个实施方案中，所述冷冻保存包括将至少 一部分浓缩的细胞群体冷冻在适合于在冷冻保存条件下储存的容器中。
[0031] 在一个实施方案中，所述容器是小瓶。在一个实施方案中，所述容器具有至少2mL 的体积。在一个实施方案中，所述容器具有至少约5mL的体积。
[0032] 在一个实施方案中，所述高密度冷冻细胞库包含约4. 5xKT8个细胞。
[0033] 在一个实施方案中，所述容器是冷冻袋。在另一个实施方案中，冷冻袋具有约5至 约150mL的体积。
[0034] 在一个实施方案中，所述高密度冷冻细胞库具有约Ix10~8个细胞/mL的细胞密 度。
[0035] 在一个实施方案中，所述灌注生物反应器中的灌注速率为至少约0. 2nL/细胞/ 天。
[0036] 在一个实施方案中，所述灌注生物反应器细胞培养物具有约7的pH和至少约40% 的溶解氧浓度。
[0037] 在一个实施方案中，所述生物反应器是柔性袋式生物反应器。在另一个实施方案 中，所述柔性袋式生物反应器具有IOL的体积。在另一个实施方案中，所述柔性袋式生物反 应器具有至少20L的体积。在另一个实施方案中，所述柔性袋式生物反应器进一步包含至 少一个汲取管（diptube)。
[0038] 在一个实施方案中，所述高密度冷冻细胞库具有至少60%的解冻后活力。在另一 个实施方案中，所述高密度冷冻细胞库具有至少90 %的解冻后活力。在另一个实施方案中， 所述高密度冷冻细胞库具有至少95 %的解冻后活力。
[0039] 在一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，所述哺乳动 物细胞选自下组：CHO、CHO-DBXl1、CH0-DG44、CHO-S、CHO-Kl、Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、 HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NSO、CRL7030、HsS78Bst细胞、 PER.C6、SP2/0-Agl4和杂交瘤细胞。
[0040] 在一个实施方案中，所述细胞是经转染的细胞。
[0041] 在一个方面，本发明提供用于产生高密度冷冻细胞库的非离心方法，所述方法包 括：a)在灌注生物反应器中培养细胞，所述灌注生物反应器偶联至交替切向流过滤系统， 其中所述生物反应器包含柔性袋式生物反应器，并且其中所述过滤器具有至少〇. 3m2的过 滤器表面积，和具有至少50kDa的MffCO尺寸的过滤器；b)使用交替切向流过滤系统以非离 心的方式浓缩所述细胞，以产生具有约I.IxKT8个细胞/mL的密度的浓缩的细胞群体；c) 冷冻保存所述浓缩的细胞群体以产生高密度冷冻细胞库，其中所述冷冻保存包括以约5% 至约10%体积/体积的终浓度将DMSO添加至浓缩的细胞群体；并且其中所述高密度冷冻 细胞库具有约lxKT8个细胞的细胞密度。
[0042] 在一个实施方案中，所述培养物的pH和DO通过自动化方法控制。
[0043] 在一个实施方案中，所述培养物的pH和DO通过非自动化方法控制。在另一个实 施方案中，所述PH和DO通过以下中的任何一种或多种控制：调节引入至所述培养物中的气 体的混合物，调节生物反应器的摇动速率，或调节生物反应器的摇动角度。
[0044] 在一个实施方案中，所述生物反应器以15rpm以8°的摇动角度摇动。
[0045] 在一个方面，本发明提供用于产生高密度冷冻细胞库的非离心方法，所述方法包 括：a)在灌注生物反应器中培养细胞，其中搅拌所述生物反应器以进行有效的混合和气体 交换，其中将所述生物反应器偶联至细胞保留系统；b)以非离心的方式浓缩所述细胞以产 生浓缩的细胞群体；和c)冷冻保存浓缩的细胞群体以产生高密度冷冻细胞库。
[0046] 在一个实施方案中，所述细胞保留系统包含交替切向流过滤系统，所述交替切向 流过滤系统包含过滤器。在另一个实施方案中，所述过滤器具有至少〇. 3m2的表面积。在另 一个实施方案中，所述过滤器具有约〇. 5至约I.Om2的表面积。在另一个实施方案中，所述 过滤器具有约〇. 7至约0.Sm2的表面积。在另一个实施方案中，所述过滤器具有约2. 0至 约3.Om2的表面积。在另一个实施方案中，所述过滤器具有约4至约5m2的表面积。
[0047] 在一个实施方案中，所述过滤器具有选自0. 2ym、0. 4ym和0. 65ym的孔径。
[0048] 在一个实施方案中，所述浓缩的细胞群体具有选自LOx10~8个细胞/mL、l.Ix 1(T