8 个细胞/mL、1.2x1(T8 个细胞/mL、1.3x1(T8 个细胞/mL、1.5x1(T8 个细胞/mL、1.7x 10~8个细胞/mL和2.Ox10~8个细胞/mL的细胞密度。
[0049] 在一个实施方案中，所述冷冻保存包括以约5%至约10%体积/体积的终浓度将 DMSO添加至浓缩的细胞群体。在另一个实施方案中，所述冷冻保存包括将至少一部分浓缩 的细胞群体冷冻在适合于在冷冻保存条件下储存的容器中。
[0050] 在一个实施方案中，所述容器是小瓶。在一个实施方案中，所述容器具有至少2mL 的体积。在一个实施方案中，所述容器具有约5mL的体积。
[0051] 在一个实施方案中，所述高密度冷冻细胞库包含约4. 5xKT8个细胞。
[0052] 在一个实施方案中，所述容器是冷冻袋。在另一个实施方案中，冷冻袋具有约5至 约150mL的体积。
[0053] 在一个实施方案中，所述高密度冷冻细胞库具有约lxKT8个细胞/mL的细胞密 度。
[0054] 在一个实施方案中，所述灌注生物反应器中的灌注速率为约0. 2nL/细胞/天至约 〇? 5nL/细胞/天。
[0055] 在一个实施方案中，所述关注生物反应器细胞培养物具有约6. 8至约7. 2的pH。
[0056] 在一个实施方案中，所述灌注生物反应器细胞培养物具有至少约30 %的溶解氧浓 度。
[0057] 在一个实施方案中，所述生物反应器是柔性袋式生物反应器。在另一个实施方案， 所述柔性袋式生物反应器具有IOL的体积。在另一个实施方案中，所述柔性袋式生物反应 器具有至少20L的体积。在另一个实施方案中，所述柔性袋式生物反应器进一步包含至少 一个汲取管。
[0058] 在一个实施方案中，所述高密度冷冻细胞库具有至少60%的解冻后活力。在另一 个实施方案中，所述高密度冷冻细胞库具有至少90 %的解冻后活力。在另一个实施方案中， 所述高密度冷冻细胞库具有至少95 %的解冻后活力。
[0059] 在一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，所述哺乳动 物细胞选自下组：CHO、CHO-DBXl1、CH0-DG44、CHO-S、CHO-Kl、Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、 HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NSO、CRL7030、HsS78Bst细胞、 PER.C6、SP2/0-Agl4和杂交瘤细胞。
[0060] 在一个实施方案中，所述细胞是经转染的细胞。
[0061] 在一个方面，本发明提供用于产生高密度冷冻细胞库的非离心方法，所述方法包 括：a)在灌注生物反应器中培养细胞，所述灌注生物反应器偶联至交替切向流过滤系统， 其中所述生物反应器包含柔性袋式生物反应器，并且其中所述过滤器具有至少〇. 3m2的过 滤器表面积，和具有至少50kDa的MffCO尺寸的过滤器；b)使用交替切向流过滤系统以非离 心的方式浓缩所述细胞，以产生具有约I. 〇xKT8个细胞/mL的密度的浓缩的细胞群体；c) 冷冻保存浓缩的细胞群体以产生高密度冷冻细胞库，其中所述冷冻保存包括将DMSO添加 至浓缩的细胞群体至约5%至约10%体积/体积的终浓度；并且其中所述高密度冷冻细胞 库具有约1(T8个细胞的细胞密度。
[0062] 在一个实施方案中，所述培养物的pH和DO通过自动化方法控制。
[0063] 在一个实施方案中，所述培养物的pH和DO通过非自动化方法控制。在另一个实 施方案中，所述PH和DO通过以下中的任何一种或多种控制：调节引入至所述培养物中的气 体的混合物，调节生物反应器的摇动速率，或调节生物反应器的摇动角度。
[0064] 在一个实施方案中，所述生物反应器至少以15rpm的速率并以至少8°的摇动角 度摇动。
[0065] 在一个实施方案中，所述生物反应器以15rpm并以8°的摇动角度摇动。
[0066] 在一个实施方案中，所述生物反应器以22rpm并以10°的摇动角度摇动。
[0067] 附图简述
[0068] 图1 :是高密度细胞冷冻存储方法的图。
[0069] 图2 :是描述使用不同细胞保留方法的WAVE?灌注培养物的细胞生长谱的图 表。
[0070] 图3 :是使用在生长期间多个时间点收获的培养物制备的小型库（mini-bank)的 存储后表现（活细胞密度（Xv)，活力）的图。
[0071] 图4 :是使用在生长期间多个时间点收获的培养物制备的小型库的存储后表现 (晚期凋亡）的图。
[0072] 图5 :是显示具有和不具有自动化pH和DO反馈控制条件下的细胞生长的图。
[0073] 图6 :是显示具有和不具有自动化pH和DO反馈控制的条件下的pH和DO谱的图。
[0074] 图7A-B:是在以下不同阶段的细胞的活细胞密度（A)和晚期凋亡⑶的图：浓缩 前、浓缩后和暴露于DMSO之后0-120分钟。
[0075] 图8A-B:是与正常密度库相比，rCHO细胞系1高密度库的存储后性能（A)和晚期 凋亡（B)的图。
[0076] 图9A-B:是与正常密度库相比，rCHO细胞系2高密度库的存储后性能（A)和晚期 凋亡（B)的图。
[0077] 图10A-B:是与正常密度库相比，rCHO细胞系3高密度库的存储后性能（A)和晚期 凋亡（B)的图。
[0078]图11:是表明使用不同细胞保留系统时，随时间经过的培养物的浓度的图。
[0079]发明详述
[0080] 本公开提供高密度细胞冷冻存储的方法，包括使用与非离心细胞保留装置连接的 灌注培养系统。
[0081]I?定义
[0082] 如用于本文，术语"分批培养"指如下细胞培养技术，其中用细胞接种一定量的新 鲜培养基，所述细胞快速进入对数生长期，并且其中不连续移出并用新鲜培养基替换所述 培养的生长培养基。
[0083] 如用于本文，术语"补料分批培养"指如下细胞培养技术，其中最初用细胞接种一 定量的新鲜培养基，并在培养过程期间向培养物（连续或以不连续的增量）补料另外的培 养营养物，在培养终止之前进行或不进行周期性细胞和/或产物收获。
[0084] 如用于本文，术语"灌注培养"指如下细胞培养技术，其中用细胞接种一定量的新 鲜培养基，所述细胞快速进入对数生长期（同上），并且其中从培养物连续移出生长培养基 并且用新鲜培养基替换。
[0085] 如用于本文，术语"生物反应器"应指用于培养细胞的容器。
[0086] 在一个实施方案中，生物反应器是"柔性袋式生物反应器"。"柔性袋式生物反应 器"是一种无菌腔，其能够容纳液体培养基并且额外地包含连接器、端口、接合器（adaptor) 和柔性管道。在一个实施方案中，所述腔由塑料制成。在具体实施方案中，所述腔由多层层 压透明塑料制成。在进一步的具体实施方案中，所述腔由多层层压透明塑料制成，并且具有 由USPVI级乙烯醋酸乙烯酯/低密度聚乙烯共聚物制成的液体接触层，同时外层由低密度 聚乙稀制成。
[0087] 另外，所述连接器、端口和接合器可以由任何类型的塑料制成，包括但不限于：聚 乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯；而所述管道可以由任何类型的塑料构建，包括但不限于：热塑弹 性体或聚硅氧烷（例如，钼固化聚硅氧烷（platinum-curedsilicone))。
[0088] 合适的"柔性袋式生物反应器"腔在本领域可以是常见的，并且包括但不限于美国 专利号6, 544, 788中所述的那些，将该专利通过提述整体并入本文。
[0089] 所述"柔性袋式生物反应器"腔可以用培养基部分填充，然后充气至硬挺。然后可 以将其置于摇动平台上（如BASE20/50EHT摇动单元，来自GELifeSciences)，所述摇动 平台通过预设的摇动角度和预设的摇动速率往复移动。这种摇动运动引起培养基中的波 浪状运动，促进搅拌和氧气转移，从而改进细胞培养的性能。预设摇动角度可以是至少约4 度，例如约4度、5度、6度、7度、8度、9度、10度、11度或12度。另外，预设摇动速率可以 按照每分钟摇动速率（rpm)设定，其为至少约6rpm，例如约7rpm、8rpm、9rpm、10rpm、llrpm、 12rpm、13rpm、14rpm、15rpm、16rpm、17rpm、18rpm、19rpm、20rpm、21rpm、22rpm、23rpm、 24rpm、25rpm、26rpm、27rpm、28rpm、29rpm、30rpm、31rpm、32rpm、33rpm、34rpm、35rpm、 36rpm、37rpm、38rpm、39rpm或40rpm。在具体的实施方案中，每分钟的摇动速率为约8rpm。 在具体的实施方案中，每分钟的摇动速率为约15rpm。在另一具体的实施方案中，每分钟的 摇动速率为约22rpm。
[0090] 如用于本文，术语"细胞保留系统"指能够通过使用过滤器将细胞与在其中的培 养基和废料产物分开的全部装置。过滤器可以包括任何形状的膜、陶瓷或金属过滤器，所 述形状包括螺旋盘绕、管状或片状。过滤器可以具有不同的表面积。例如，过滤器表面积 可以是约 〇? 3m2至约 5m2,例如，约 0? 3m2、0. 4m2、0. 5m2、0. 6m2、0. 7m2、0. 77m2、0. 8m2、0. 9m2、 1. Om2、I.lm2、I. 2m2、I. 3m2、I. 4m2、I. 5m2、I. 6m2、I. 7m2、I. 8m2、I. 9m2、2.Om2、2.lm2、2. 2m2、 2. 3m2、2. 4m2、2. 5m2、2. 6m2、2. 7m2、2. 8m2、2. 9m2、3.Om2、3.lm2、3. 2m2、3. 3m2、3. 4m2、3. 5m2、 3. 6m2、3. 7m2、3. 8m2、3. 9m2、4.Om2、4.lm2、4. 2m2、4. 3m2、4. 4m2、4. 5m2、4. 6m2、4. 7m2、4. 8m2、4. 9m2 或约5m2。在某些实施方案中，所述过滤器模块具有从约10千道尔顿（kDa)至约IOOkDa 的分子量截留（MffCO)大小，例如其为约 10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、 80kDa、90kDa或lOOkDa。在其他实施方案中，所述过滤器模块具有从约0.Iym至约3ym， 例如约 〇?Iym、0. 2ym、0. 3ym、0. 4ym、0. 5ym、0. 6ym、0. 65ym、0. 7ym、0. 8ym、0. 9ym、 2.Iym、2. 2ym、2. 3ym、2. 4ym、2. 5ym、2. 6ym、2. 7ym、2. 8ym、2. 9ym或约 3. 0ym的筛 目或孔径。
[0091] 如用于本文，术语"冷冻保存（cryopreservation) "指如下过程，通过该过程将容 易因为时间或因为酶或化学活性造成损伤的细胞、组织或任何其他物质通过将它们降温并 储存至零下的温度来保存。
[0092] 如用于本文，术语"冷冻储存（banking) "指如下技术，通过该技术将细胞与冷冻 保护剂（例如，具有或不具有羟乙基淀粉0ES)的DMS0)混合并置于适合于在冷冻保存条 件下的储存的容器中。然后将这些容器使用本领域熟知的技术冷冻，并在低温储存，通常在 约-130°C至约_195°C。通过该过程获得的细胞收集物（collection)是细胞库。
[0093] 在一个实施方案中，所述细胞库是高密度细胞库。如用于本文，术语"高密度细胞 库"应指已经以高密度进行了冷冻的冷冻存储的细胞等分试样，其中所述是至少约7x10~7 个活细胞/1^，例如，其是约7110~7个活细胞/1^、8110~7个活细胞/1^、9110~7个活细 胞/mL、lxKT8个活细胞/mL、2xl(T8个活细胞/mL或3xKT8个活细胞/mL。可以根据本 领域可用的任何方