一株分泌抗p53单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株分泌抗P53单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。具体而言，本 发明提供了一种抗肿瘤细胞表面抗原P53分子的单克隆抗体，对该抗体重链和轻链可变区 的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可以用于通过人工或自动化方 式，以免疫组织化学染色（IHC)、酶联免疫吸附（ELISA)或免疫印迹（WesternBlot)方式检 测细胞中P53的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法中，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002]p53jk一种肿瘤抑制基因（tumorsuppressorgene)，1979年首次被报道，其编 码的蛋白质在Uniprot数据库中的编号为P04637. 4。作为重要的细胞周期调控转录因子 (transcriptionalfactor)，它控制着细胞周期，通过调控其网络内160余种基因的表达决 定多种细胞的分裂与凋亡。正常细胞通过向P53蛋白发送健康信号以维持细胞分裂，受损 细胞不能修复时，P53蛋白将参与启动细胞凋亡（apoptosis)过程。存在P53蛋白缺陷的细 胞会失去这种控制，甚至在不利条件下继续分裂。P53基因在正常情况下对细胞分裂起着减 慢或监视的作用，在人类50%以上的肿瘤组织中均发现了灰以基因的突变，这是肿瘤中最常 见的遗传学改变，说明该基因的改变很可能是人类肿瘤产生的主要发病因素。
[0003] 基因突变后，由于其空间构象发生改变，失去了对细胞生长、凋亡和DNA修复 的调控作用，基因由抑癌基因转变为癌基因。多种肿瘤，如肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、 结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等， 人类肿瘤中的P53有突变发生，突变主要集中在高度保守的区域内，以175、248、249、273、 282位点突变率最高，不同种类肿瘤不同，如结肠癌和乳腺癌有相似的流行病学，但P53突 变谱并不一致，结肠癌G:CA:T转换占79%，而且多数CpG，二核苷酸位点，50%以上转换突变 发生在第3~5结构域的CpGC位于码子175、248、273 ;在乳腺癌中，只发现13%的转换在 CpG位点。此外，G-T颠换在乳腺癌占1/4,但在结肠癌罕见。淋巴瘤和白血病的P53,突变 方式与结肠癌相似，即大部分突变为CPG位点的转换，G-T颠换较低，A:T-G:C在A:T 位点突变较高。伯基特淋巴瘤与其它B细胞淋巴瘤和T淋巴细胞恶性病变的灰^变谱相 似，在非小细胞肺癌中G:C-T:A最普遍，食道癌颠换率很高，与肺癌不同的是，G:C和A:T 位点有相似的突变率。我国启东地区50%为249癌码子的G-C、G-T颠换，而南非肝癌 80%为G-T颠换。骨肉瘤中变率为75%，主要集中在5~9外显子。
[0004] 依据以上对基因编码序列和蛋白质表达水平的变化可以对肿瘤的发生和 预后进行评估。对于/^^的检测大体分为基因水平的检测和蛋白质水平的检测两大 类，其中对基因的检测多以定量PCR或芯片方式检测基因的表达水平，或通过探针 法定量PCR的方法检测发生突变的基因位点，或以其他检测单核苷酸多态（sing1e nucleotidepolymorphism,SNP)性的方法检测基因的SNP情况。对于蛋白的检测， 分为常规的ELISA方式、抗体芯片方式，以包括临床常用的免疫组化方式，处于检测目的 的不同，检测的蛋白包括野生型P53蛋白，也包括特定的突变体检测。对野生型申请号为 "CN201210274649"的发明专利"抗肿瘤蛋白P53单克隆抗体及其用途"公开了一种P53单 克隆抗体在为胃癌、肝癌、大肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴造血系统肿瘤、胶质细胞 瘤、软组织肉瘤中作为免疫组化检测试剂的用途，对其检测灵敏度和特异性做了简单测试。 除对P53蛋白进行检测外，对于体内的P53蛋白自身抗体的检测也有助于对肿瘤的判断，发 明专利"一种血清自身抗体检测试剂盒（CN201410146727)"和"p53自身抗体识别的抗原多 肽、试剂盒及在制备检测肿瘤试剂盒中的应用（CN200810222871)"以及"检测抗P53抗体的 测定方法（CN97180373)"分别从试剂盒组成、适用的肿瘤范围以及特定抗原的制备方法等 方面描述了检测P53特异性自身抗体的做法和用途。为进一步提高对肺癌检测的准确度， 发明专利"一种用于肺癌诊断的液相芯片试剂盒"（【申请号】CN201310290079)将对P53自 身抗体的检测纳入液相抗体芯片之内，与对p62、CTAG和CAGE蛋白自身抗体的检测一并纳 入判断范围。
[0005] 针对以上研究现状，以及目前在检测领域使用较为广泛的抗P53单克隆抗体D0-7 在应用中的特征，我们试图通过制备高质量的抗原，进行动物免疫后对大规模组织芯片进 行筛选与鉴定，获得在检测灵敏度和特异性更具优势的抗P53单克隆抗体，并建立适宜的 免疫检测的试剂盒制备方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种制备P53重组蛋白的方法，该重组蛋白由P53蛋 白及用于纯化的组氨酸标签组成。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种可分泌特异性好，亲和力高的P53单克隆抗体细 胞株及其制备方法，该抗体能特异结合P53重组抗原和天然抗原。
[0008] 本发明的第三个目的是提供一种将本抗体用于肿瘤组织切片免疫组织化学检测 的使用方法。
[0009] 解决技术问题所采用的技术手段 本发明针对在乳腺肿瘤、胃肠道肿瘤、肝细胞肿瘤及呼吸道肿瘤等多种肿瘤组织中表 达异常的P53蛋白分子，按照公布的蛋白序列（Uniprot数据库中P04637. 4)及其对应的 mRNA编码（GenBankID:NM_000546)进行分析，基因合成p53编码序列，为便于纯化，在重组 蛋白的C端融合有组氨酸标签，经基因合成后克隆进表达质粒载体pET-28a中进行重组表 达，分离纯化表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞 融合、重组P53和天然肿瘤细胞系筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞 系。
[0010] 利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，ProteinA/G柱亲和层析纯化腹水，获 得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG2a型单克隆抗体，亲和常 数为3. 02X109。免疫印迹（Westernblotting)实验显示该抗体能特异识别重组的p53蛋 白以及表达P53分子的Jurkat细胞系。
[0011] 具体地，本发明涉及以下几个方面： 1. 一种单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞系70237-85分泌。所述小鼠杂交瘤细胞系 70237-85,该细胞系已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心保藏，保藏号为CGMCCN0. 10401。地址为北京市朝阳区北辰西路一号院3号。
[0012] 2.所述的单克隆抗体，其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表中SEQIDNo. 1的核 苷酸序列编码经由大肠杆菌重组表达而获得的重组P53抗原蛋白。
[0013] 3.所述的单克隆抗体，其重链和轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNo. 2和SEQID No. 3所示的DNA序列所编码。
[0014] 4.所述的单克隆抗体，其重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQIDNo. 4和 SEQIDNo. 5所示的氨基酸序列。
[0015] 5.所述的单克隆抗体，其为小鼠IgG2a亚型单克隆抗体。
[0016] 6.所述的单克隆抗体，其识别重组P53和肿瘤细胞内的P53蛋白分子。
[0017] 7.所述的单克隆抗体，其用于免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法检 测肿瘤及正常组织细胞中的P53蛋白的表达情况。
[0018] 8.所述的单克隆抗体在免疫组化病理诊断剂上的应用。
[0019] 9.所述的重组P53抗原蛋白，该重组蛋白由全长为393氨基酸的P53蛋白及用于 重组蛋白纯化的六个组氨酸标签组成。
[0020] 本发明的优点及有益效果 (1)本发明获得的杂交瘤（70237-85)分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋白P53和 表达P53的淋巴瘤Jurkat细胞中的天然蛋白，并且能够检测高表达P53蛋白的食管鳞状细 胞癌、胃腺癌、肠腺癌、宫颈鳞状细胞癌、血管瘤、纤维肉瘤、真皮纤维瘤等多种肿瘤组织。
[0021] (2)本发明获得的杂交瘤（70237-85)为一种IgG2a类抗体，与P53蛋白