过夜，PBS-T洗3次。每 孔加200yL封闭液37°C封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1 :200 开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠 二抗1 :20000稀释，每孔100yL，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。每孔加入100yL含0?lwt% TMB(Sigma公司）和0. 03wt%H202的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50yL0. 5M硫酸 溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出0D值对应抗体稀释倍数的曲线， 找出多1/2 "平台0D值"对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为3. 02X109。
[0038] 单抗反应特异性和应用效果 选择可表达P53蛋白的肿瘤细胞系Jurakt细胞，取培养的细胞约106,离心去除培养 基后，以磷酸缓冲液重悬细胞，再次离心去除上清，加入200yL磷酸缓冲液重悬，超生破碎 细胞后，以BCA方法继续蛋白定量。用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别天 然P53蛋白的特异性，免疫印迹实验过程如下：细胞裂解物上样70yg/泳道，进行12%聚 丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上 (Millipore公司）。将膜置于含5wt%脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4°C过夜。加入浓度为 lmg/mL单克隆抗体70237-85 (1 :1000稀释)4°C孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1 :5000 稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司），室温孵育1小时。再次TBST洗膜， 加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司），以ChemiDocMP多色荧光成像系统 (Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。
[0039] 实施例4抗体的可变区序列测定 培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，要证实用于克隆的细胞株的 确能分泌需要的抗体，证实完成后，离心收集1〇6以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交 瘤细胞总RNA，取 9yL总RNA，加入 2. 5yLoligo(dT) 12 - 18primer(10mM)，及 5yL dNTPs，混合均匀，70°C保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。 随后加入5yLRTbuffer(5X)，2.5yLDIT(0.1M)及lyL逆转录酶，42°C反应 1 小 时。70°C孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20°C。将获得的第一链cDNA进行 PCR扩增，在50yL反应体系中加入引物各25pmol，引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗 体》（科学出版社，2005年出版）一书中鼠单抗引物序列设计和合成。其余dNTPs及缓冲液 均按照常规加入，最后加入cDNA模板加入1yL和1U热启动TaqDNA聚合酶。设置PCR扩 增程序，通常为94°C40秒，52°C40秒，72°C40秒，进行20至25个循环，最后72 °C延伸3 分钟，产物可置于4°C备用或直接电泳。取20yLPCR产物进行电泳分析，在1.5%琼脂糖 凝胶上分离，轻链（k轻链）的长度在320-340bp之间，重链的长度在340-370bp之间，有 该区域特异产物时切胶回收，克隆至T载体或表达载体测序。
[0040] 实施例5.组织芯片染色和鉴定 5. 1芯片制备过程 对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作 空白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在65~70°C)倒入模具，冷却 至室温后将模具放入-20°C冰箱6min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1mm 直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3~4 _，用另一直径1mm的打孔针在蜡块的标记部 位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0. 1mm左右。将采集到的组织芯直接插入 或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后用 载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块 制作模具，放入 6(TC烤箱内1h，使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取 出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入-20°C冰箱冷冻6min后 将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4°C冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚 度定为4ym，将连续切片漂在凉水中，让其自然展开，再将分开的切片转移到45°C的温水 中展片30秒，用经2wt%APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入 60 °C烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入-4 °C冰箱保存。
[0041] 染色及分析 常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟， 最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3X3分钟。滴加3%H202 孵育10分钟，PBS冲洗3X3分钟。甩去PBS，滴加封闭液(动物非免疫血清）室温孵育10 分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比 例）室温（25°C)孵育1小时，PBS冲洗3X3分钟，滴加二抗室温孵育20-30分钟，PBS冲洗 3X3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返 蓝30秒。按照85% (3分钟）-95% (3分钟）-100% (3分钟）-100% (3分钟）的酒精梯度依 次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。
[0042] 数据统计 根据各抗体在样本点的着色情况，统计各指标的着色率(着色样本数/样本总数)，见表 1〇
[0043] 表1本发明p53抗体70237-85同商品抗体D0-7在不同肿瘤上的检测差异比较
【主权项】
1. 一株分泌抗P53单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述细胞株为小鼠杂交 瘤细胞系70237-85,该细胞系已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO. 10401。2. -种单克隆抗体，其特征在于：由小鼠杂交瘤细胞系70237-85分泌。3. 权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于：其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表 中SEQ ID No. 1的核苷酸序列编码经由大肠杆菌重组表达而获得的重组P53抗原蛋白。4. 权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的重组P53抗原蛋白由全长为393 氨基酸的P53蛋白及用于重组蛋白纯化的六个组氨酸标签组成。5. 权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于：其重链和轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示的DNA序列所编码。6. 权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于：其重链和轻链可变区氨基酸序列分别 为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列。7. 权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于：其为小鼠IgG2a亚型单克隆抗体。8. 权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于：其识别重组P53和肿瘤细胞内的P53蛋 白分子。9. 权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于其用于免疫组织化学法、免疫印迹法和 酶联吸附测定法检测肿瘤及正常组织细胞中的P53蛋白的表达情况。10. -种如权利要求2所述的单克隆抗体在免疫组化病理诊断剂上的应用。
【专利摘要】本发明涉及一株分泌抗P53单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，<i>p53</i>基因长度为16-20kb的DNA，位于17P13.1，其编码的蛋白质长度为393个氨基酸的核磷蛋白，分子量约为53kDa，具有监控细胞和DNA的功能，对发生损伤的细胞启动修复或诱导凋亡。P53作为转录因子、调节核心对多种蛋白的表达进行调控。制备该抗体的抗原为一段优选的、由大肠杆菌表达、具有免疫原活性的重组蛋白，最终获得的抗体属于IgG2a亚型，编码其可变区的序列经基因克隆的方式获得，对多种肿瘤组织的免疫组织化学检测发现，该抗体可以很好的鉴别肿瘤的发生，可用于这些肿瘤的免疫学诊断。CGMCC NO.1040120150205
【IPC分类】C07K16/32, G01N33/577, C12N5/20, C12R1/91
【公开号】CN105112377
【申请号】CN201510619811
【发明人】杨清海, 陈惠玲, 王小亚
【申请人】福州迈新生物技术开发有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月25日