一种人源精氨酸酶突变体及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种人源精氨酸酶突变体及其制备方法和 用途，所述人源精氨酸酶突变体与天然的人源Arginase相比，在生理条件下具有活性更 高、更稳定的优点。
【背景技术】
[0002] 研究发现，许多肿瘤细胞存在一种或多种氨基酸合成障碍的情况，因而必须依赖 血清中的氨基酸补给才能存活。这些对肿瘤细胞生存必须的氨基酸系统性消除会使这些恶 性肿瘤细胞凋亡，同时对正常细胞几乎不产生任何副作用。酶介导的细胞外氨基酸清除机 制成为一种新颖的癌症或其他疾病的治疗方法逐渐被人所熟悉。氨基酸缺失应用的最早例 子是天冬酰胺酶，它能分解细胞生长和细胞生命维持所需的天冬酰胺。在许多白血病患者 中，白血病细胞与正常细胞不同，它们自身不能合成天冬酰胺，必须依靠外界提供的天冬酰 胺来维持生存。天冬酰胺酶的治疗耗尽体内肿瘤细胞所需的游离天冬酰胺，从而导致肿瘤 细胞死亡，而正常细胞不会受到太大影响。同时在癌症治疗方面，氨基酸缺失相比其他途径 具有更好的优势，因为对于那些血管化程度差或者隐藏在难以触及处的肿瘤组织都能起到 很好的作用。因此，与抗体药物不同，酶介导的治疗方法并不依赖于肿瘤穿透。
[0003] 近年来，氨基酸缺失治疗应用研究的热点主要是L-精氨酸（L-arginine)。绝 大部分的肝癌、黑色素瘤、肾癌和前列腺癌组织细胞都不表达琥珀酸精氨酸合成酶 (Argininosuccinatesynthase，ASS)，因而会对L-arginine缺失敏感。2007 年，Cheng等 发现许多肝癌细胞鸟氨酸转氨甲酰酶（Ornithinetranscarbamylase)表达缺陷因而必须 依赖外源的L-arginine供给。L-arginine缺失对于肝癌、黑色素瘤及其他尿素循环缺陷型 癌细胞的选择性毒性已经做过大量的体外实验（包括动物模型和临床研究）。
[0004] 精氨酸脱亚氨酶（ADI)能催化精氨酸向胍氨酸的转化，可被用来清除精氨酸。 J.B.Jones和Takaku分别从恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)和支原体（Mycoplasma arginini)中分别发现了能水解精氨酸的ADI，然而，这2种ADI毕竟是原核来源，与人的种 属差异性极大，进入人体后很容易诱导生成抗体，形成抗原-抗体免疫复合物，从实验动物 的血液循环中被快速清除。尽管有人可以将ADI进行PEG修饰，但是PEG-ADI(ADI-PEG2_) 产品的二期临床研究表明，ADI仍然在体内引发严重的中和抗体反应，表明种属差异性引起 的免疫原性问题并未得到解决。
[0005] 近年来，人源的精氨酸水解酶（Arginase)被认为是L-arginine缺陷治疗途径最 有希望的产品。人体产生2种Mn2+依赖的Arginase异构体，都能将L-arginine催化水解为 尿素和鸟氨酸。I型精氨酸水解酶（Arginase1)基因位于6号染色体上，主要在肝脏的细 胞质中表达并且在尿素循环的最终步骤起到脱氮的作用。而II型精氨酸水解酶（Arginase 2)基因位于14号染色体，主要在肾、脑和骨骼肌组织的线粒体中表达，为提供多胺和脯氨 酸的合成提供L-鸟氨酸。早期临床研究表明，Arginase1对于一些肝癌患者能起到缓解作 用。然而，Arginase1的最适pH条件为~9. 5,因而在生理条件（pH7. 4,血清L-arginine 含量~120yM)下，活性并不高，并且KM(2. 3mM)很高，与底物L-arginine的亲和力很低， 加上稳定性也较差（血清tl/2约为4. 8h)。因而，如何能获得一种免疫原性低且活性高的 精氨酸水解酶，是目前科学界的一大研究热点。
【发明内容】
[0006] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种人源精氨酸酶突变体 及其用途，用于解决现有技术中的问题。本发明所提供的人源精氨酸酶突变体与天然的人 源Arginase相比，在生理条件下活性更高、更稳定。
[0007] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种人源精氨酸酶突变 体，所述人源精氨酸酶突变体选自：
[0008] 与SEQIDNO: 1具有80%以上同源性的多肽；或，
[0009] 包含与SEQIDNO: 1具有80%以上同源性的多肽和用于延长半衰期的载体蛋白部 分的融合蛋白。
[0010] 优选的，所述人源精氨酸酶突变体选自：
[0011] (1)氨基酸序列如SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3 或SEQIDNo. 4 所示的多肽；
[0012] (2)氨基酸序列与SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3或SEQIDNo. 4所示的多肽具有 90%以上同源性，且具有SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3或SEQIDNo. 4所示的多肽功能的多 肽；
[0013] (3)包含⑴和⑵所述的多肽和用于延长半衰期的载体蛋白部分的融合蛋白。
[0014] 优选的，所述（2)中的多肽具体指，3￡〇10吣.2、3￡〇10吣.3或3￡〇10吣.4所 示的多肽经过取代、缺失或者添加一个或多个氨基酸而得到的，且具有SEQIDNo. 2、SEQID No. 3或SEQIDNo. 4所示的多肽功能的多肽。
[0015] 优选的，所述用于延长半衰期的载体蛋白部分选自明胶样单元（GLK)，聚乙二醇 (PEG)，人血清白蛋白（HSA)等中的一种或多种的组合。
[0016] 更优选的，所述用于延长半衰期的载体蛋白部分的氨基酸序列如SEQIDN0:5所 不。
[0017] 进一步优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo. 6、SEQIDNo. 7或SEQ IDNo. 8。
[0018] 优选的，所述人源精氨酸酶突变体由SEQIDNo. 13-18所示的多核苷酸序列编码。
[0019] 本发明第二方面提供一种分离的多核苷酸，编码所述人源精氨酸酶突变体。
[0020] 优选的，所述多核苷酸的序列如SEQIDNo. 13-18所示。
[0021] 本发明第三方面提供一种重组表达载体，包含所述多核苷酸。
[0022] 本发明第四方面提供一种宿主细胞，所述细胞含有所述表达载体或基因组中整合 有外源的所述的多核苷酸。
[0023] 本发明第五方面提供一种人源精氨酸酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
[0024] 1)培养所述宿主细胞，使之表达所述人源精氨酸酶突变体；
[0025] 2)收集含有所述人源精氨酸酶突变体的培养物；
[0026] 3)从步骤2所得培养物中分离出所述人源精氨酸酶突变体。
[0027] 本发明第六方面提供一种组合物，含有所述人源精氨酸酶突变体或所述宿主细胞 的培养物，以及药学上可接受的载体。
[0028] 本发明第七方面提供所述人源精氨酸酶突变体在制备或筛选L-arginine缺陷治 疗药物中的用途。
[0029] 优选的，所述L-arginine缺陷治疗药物具体为尿素循环缺陷型癌症治疗药物。
[0030] 更优选的，癌症选自肝癌、黑色素瘤中的一种或多种的组合。
【附图说明】
[0031] 图1显示为本发明Arg/pPIC9的质粒构建流程示意图。
[0032] 图2显示为本发明mArg-rGLK1164表达载体示意图。
[0033] 图3显示为本发明纯化蛋白电泳图，其中1.Arginasel，2.mArgl，3.mArg2， 4.mArg3, 5.mArgl_rGLK1164,6.mArg2_rGLK1164, 7.mArg3_rGLK1164,M:分子量Marker。
[0034] 图4显示为本发明Arginase1及突变体对L-精氨酸的水解活性示意图。
【具体实施方式】
[0035] 除非下文另外定义，本发明所提及的所有技术和科学用语具有本发明所属领域的 技术人员通常理解的意义。
[0036] 如本文所述，术语"免疫原性"是指能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的特性。
[0037] 如本文所述，术语"融合"是指在分子水平上对蛋白质进行改造。即在体外将蛋白 质的编码基因通过PC