R、酶切、连接等分子生物学手段，将两种或以上的蛋白或多肽片段连 接在一起，置于同一启动子下进行表达。
[0038] 如本文所述，术语"明胶样单元"（GLK)是指具有（Gly-X_Y)n结构的重复单元组成 的一段多肽或蛋白，Gly为甘氨酸残基；X和Y分别为20种天然氨基酸除了Cys之外的任意 氨基酸残基，且n为20-300。
[0039] 如本文所述，术语"氨基酸残基"指任何天然或非天然氨基酸残基，尤其是20个天 然氨基酸中的氨基酸残基。
[0040] 如本文所述，术语"半衰期"是指药物从体内消除一半所需的时间，也是血药浓度 下降一半所需要的时间，用t1/2表示。
[0041] 如本文所述，术语"IC5。"是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度（50%抑制浓度）。在 本发明中具体指一定浓度的物质诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度，即凋 亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度。
[0042] 如本文所述，生物学活性，术语"生物学活性"是指在生物体内或活细胞内具有的 某种生理功能。
[0043] 本发明发明人通过深入研究，发现了一种人源精氨酸酶突变体及其融合蛋白。所 述人源精氨酸酶突变体与其融合蛋白与天然的Arginase1相比，不仅在生理条件下能够 有效地降解精氨酸，水解精氨酸的效率显著提高，亲和力更高，而且更加地稳定，此外，还对 癌细胞有良好的抑制作用，在此基础上完成了本发明。
[0044] 本发明所提供的人源精氨酸酶突变体为I型人源精氨酸酶（Arginase1)的突变 体，所述人源精氨酸酶突变体选自与SEQIDN0:1具有80%以上同源性的多肽或包含与SEQ IDN0:i具有80%以上同源性的多肽和用于延长半衰期的载体蛋白部分的融合蛋白。所述 人源精氨酸酶突变体优选选自：
[0045] (1)氨基酸序列如SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3 或SEQIDNo. 4 所示的多肽；
[0046] (2)氨基酸序列与SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3或SEQIDNo. 4所示的多肽具有 90%以上同源性，且具有SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3或SEQIDNo. 4所示的多肽功能的多 肽；
[0047] (3)包含⑴和⑵所述的多肽和用于延长半衰期的载体蛋白部分的融合蛋白。
[0048] 在本发明中，所述（2)中的多肽具体指与SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3或SEQID No. 4所示的氨基酸序列存在差异，但其依然具有或基本具有SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3或 SEQIDNo. 4所示的多肽功能的多肽。具体来说，所述多肽可以是序列如SEQIDNo. 2、SEQ IDNo. 3或SEQIDNo. 4所示的多肽经过取代、缺失或者添加一个或多个氨基酸而得到的。
[0049] 在本发明中，所述（3)中的人源精氨酸水解酶突变体具体指（1)和（2)所述的多 肽经低免疫原性或无免疫原性的聚合物修饰或融合，而形成的融合蛋白。本领域技术人员 可选择合适的载体蛋白部分，对（1)或（2)中所述的多肽进行修饰或融合，以延长人源精氨 酸水解酶突变体在体内的半衰期，从而起到更好的治疗作用。
[0050] 所述载体蛋白部分可以是天然来源的，如葡聚糖，也可以是人工设计重组表达 的蛋白或多肽链，如明胶样单元（gelatin-likeprotein,GLK)，也可以是人工合成的化合 物，如聚乙二醇（PEG)。具体来说，可使用的用于延长半衰期的载体蛋白部分包括但不限 于明胶样单元（GLK)，聚乙二醇（PEG)，人血清白蛋白（HSA)等中的一种或多种的组合。 在本发明的其中一实施例中，所述载体蛋白部分为SEQIDN0:5的融合载体（专利号为 200980103870. 9中的rGLKl164)，构建成mArg-rGLKl164形式的融合蛋白，其具体序列如SEQ IDNo. 6、SEQIDNo. 7或SEQIDNo. 8所示。融合后，mArg部分的亲和力及活性并没有明 显的下降，动物实验表明，药效相比未融合的天然人源Arginase及mArg效果更优越。
[0051] 在本发明一优选实施例中，所述人源精氨酸酶突变体由SEQIDNo. 13-18所示的 多核苷酸序列编码。
[0052] 本发明还提供一种分离的多核苷酸，编码所述人源精氨酸酶突变体。在本发明一 优选实施例中，所述多核苷酸的序列分别为SEQIDNo. 13-18所示，分别编码氨基酸序列为 肽。
[0053] 本发明还提供一种重组表达载体，包含所述多核苷酸。所述表达载体可选自本领 域各种可适用的表达载体，只要不对本发明的发明目的产生限制即可。所述表达载体可为 原核表达载体或真核表达载体，优选为真核表达载体。具体可使用的表达载体包括但不限 于$?扣94?扣2 &4〇0嫩3.1等。在本发明一优选实施例中，所述表达载体为口？扣9载体。
[0054] 本发明还提供一种宿主细胞，所述细胞含有所述表达载体或基因组中整合有外源 的所述的多核苷酸。所述宿主细胞可选自本领域各种可适用的宿主细胞，只要不对本发明 的发明目的产生限制即可。具体可使用的宿主细胞包括但不限于：酵母、大肠杆菌、哺乳动 物细胞等，优选的宿主细胞为酵母。在本发明一优选实施例中，所述宿主细胞为甲醇酵母 Pichiapastor〇
[0055] 本发明还提供一种人源精氨酸酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
[0056] 1)培养所述宿主细胞，使之表达所述人源精氨酸酶突变体；
[0057] 2)收集含有所述人源精氨酸酶突变体的培养物；
[0058] 3)从步骤2所得培养物中分离出所述人源精氨酸酶突变体。
[0059] 所述人源精氨酸酶突变体的制备方法具体如下：培养转化有能够表达人源精氨酸 酶突变体的重组表达质粒的宿主细胞，诱导表达人源精氨酸酶突变体，发酵液离心后去除 菌体，分离纯化后即得所述人源精氨酸酶突变体。所述分离纯化的方法可选用本领域各种 可使用的纯化方法，只要不对本发明的发明目的产生限制即可。
[0060] 在本发明一优选实施例中，具体为将编码基因双酶切后与pPIC9连接，获得重组 表达质粒，将重组表达质粒转染甲醇酵母PichiapastorGS115(His)，平板划线后取单菌 落接种，培养诱导表达以后，使用柱层析进行纯化，即得所述人源精氨酸酶突变体。本发明 还提供一种组合物，含有所述人源精氨酸酶突变体或所述宿主细胞的培养物，以及药学上 可接受的载体。所述组合物优选包括有效量的所述人源精氨酸酶突变体，本领域技术人员 可根据实际用途确定组合物中人源精氨酸酶突变体的有效量。所述载体可选自本领域各种 载体，只要不对本发明的发明目的产生限制即可，具体可使用的载体包括但不限于：水、缓 冲液等。
[0061] 本发明还提供所述人源精氨酸酶突变体在制备或筛选L-arginine缺陷治疗药物 中的用途。本发明发明人通过细胞学活性实验验证，本发明所提供的人源精氨酸酶突变体 (包括mArgl、mArg2、mArg3、mArgl_rGLK1164、mArg2_rGLK1164、mArg3_rGLK1164)对HepG2 肝癌细胞的活性具有良好的抑制作用。
[0062] 本发明中，所述L-arginine缺陷治疗药物具体指通过L-arginine缺失对革巴标产 生选择性毒性，从而缓解或治疗疾病的药物。在本发明一优选实施例中，所述L-arginine 缺陷治疗药物具体为尿素循环缺陷型癌症治疗药物，更具体的，所述癌症选自肝癌。
[0063] 如上所述，本发明的人源精氨酸酶，具有以下有益效果：
[0064] 1)本发明所提供的人源精氨酸酶为I型人源精氨酸酶Arginase1的突变体，与天 然的Arginase1相比，该Arginase1突变体能在生理条件下有效地降解精氨酸，在pH值 为7. 2-7. 5的范围下，水解精氨酸的效率显著提高，亲和力更高，而且更加地稳定。
[0065] 2)本发明所提供的人源精氨酸水解酶突变体对肝癌（HCC)细胞（实施例中为 HepG2细胞）有良好的抑制作用，与天然的Arginasel相比，IC5。明显下降。
[0066] 3)本发明所提供的人源精氨酸水解酶突变体与天然Arginase1分别注射到小鼠 体内，结果表明注