非复制型病毒衍生颗粒及其用图
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年12月21日提交的美国临时专利申请No. 61/740, 856和于 2013年6月14日提交的美国临时专利申请No. 61/835, 310的优先权权益，其通过引用整体 并入文本。
技术领域
[0003] 本公开内容总体上涉及非复制型病毒衍生颗粒（non-replicating virus-derivedparticle)及其作为抗癌剂的用途。
【背景技术】
[0004] 以下背景讨论并不暗示或承认下文所述的任何内容在任何国家中是现有技术或 本领域技术人员知识的一部分。
[0005] 已通过减毒突变或缺失改造了溶瘤病毒（oncolyticvirus，0V)，其允许病毒仅在 与免疫应答受损或代谢活动增强（肿瘤发生的两个关键特征）相关的细胞中复制。目前， 先进的溶瘤治疗剂的实例包括单纯疱疹病毒（HerpesSimplexVirus)OncoVEXGM-CSF和痘 苗病毒（JX594)。迄今为止，OV领域的主要焦点一直是开发活病毒在局部肿瘤环境中具有 优先复制/扩散能力的平台。
[0006] 目前，正在研究弹状病毒（Rhabdovirusvirus，RV)(例如水疱性口炎病毒 (vesicularstomatitisvirus，VSV)和马拉巴（Maraba)作为抗癌治疗剂。在肿瘤中，不 受限制的代谢活动和受损的抗病毒程序使得病毒能够增殖。由于倾向于病毒介导的细胞凋 亡，肿瘤对RV治疗的敏感性进一步增强。
[0007] 在弹状病毒领域中，迄今开发的溶瘤平台利用其中病毒在肿瘤细胞之间扩散的具 有复制能力的病毒。实际上，描述使用活的具有复制/表达能力的弹状病毒作为癌症直接 病毒治疗的报道通常将其效力与其中未观察到可测量的效力的非复制型/非表达型病毒 对照进行比较。在这些报道中，推断弹状病毒基因组的复制和/或表达是肿瘤细胞毒性和 治疗效力的关键且必需的要素。
[0008] 这些之前的研究缺少溶瘤作用反映在用于破坏病毒基因组复制和/或表达的方 法以及所使用的病毒颗粒数目。实际上，当使用这些先前的方法破坏病毒基因组复制和/ 表达时，未观察到病毒的生物活性。此外，在这些研究中，非复制型病毒对照以与其活病毒 对应物相同的剂量而非更高的剂量施用以确保每个细胞都遇到非复制型颗粒。
[0009] 作为替代且优选更有效地，期望治疗和治愈大多数癌症形式的方法。例如，患有急 性成淋巴细胞白血病或急性髓细胞白血病的大多数成年患者的结果依然不佳。这部分地归 因于这些疾病的显著的免疫受损性质。对于少数患者而言，抗肿瘤免疫应答通过在于清髓 性预处理（myeloablativeconditioning)后进行同种异体干细胞移植而得以部分地恢复。 这种治疗具有潜在的治愈性，但与频繁的不良事件和显著的治疗相关死亡率有关。对于很 多患有慢性期慢性髓细胞白血病（chronicmyeloidleukemia，CML)的患者而言，革El向酪氨 酸激酶抑制剂（tyrosinekinaseinhibitor，TKI)治疗提供了优异的疾病控制。然而，当 发展到出现急性白血病性原始细胞危象（blastcrisis)时，由于多药抗性的出现和这种形 式的顽固性白血病的快速动力学，存在非常有限的治疗选择。
[0010] 因此，需要特别用于免疫受损患者的作为替代的抗癌剂。所述抗癌剂凭借其设计 和组分将优选能够解决目前尚未满足的临床需求和/或克服至少一些上文所讨论的问题。
[0011] 发明概述
[0012] 以下概述旨在向读者介绍本文中所述的一个或更多个发明，并非旨在对他们中的 任何一个进行限定。发明可存在于本文件中任何部分所述的特征的任意组合中。
[0013] 尽管一直在寻求治疗多种肿瘤类型的活OV策略，但是特别地其在造血系统恶性 肿瘤中的应用因若干因素而变得复杂。病毒体的产生有限和在白血病细胞间的扩散降低要 求高剂量的病毒治疗来克服这些低效性。然而，在正常组织中不受控制的活病毒扩散和脱 靶作用使这种方法的安全性受损，特别是在免疫抑制患者中。
[0014] 与使用活病毒相关的问题包括：1)安全性，其依赖于活弹状病毒只在病变肿瘤组 织中扩散而不干扰健康组织的能力；2)低剂量施用，因为向患者引入活的可扩散病毒需要 施用相对低剂量的这些活病毒剂以确保安全性；3)从肿瘤向活病毒的免疫转移，其有效地 降低抗肿瘤免疫应答的效力；和4)与野生型病毒相比，设计有针对肿瘤之倾向的经改造活 病毒具有受损的产生能力，并因此从制备方面来看，制剂效率和生产成本是次最佳的。
[0015] 先前已表明，用被改造成缺失糖蛋白基因（阻止最后的病毒体装配和扩散）的 VSV(VSVAG)进行瘤内注射引起抗肿瘤免疫应答。然而，用VSVAG治疗不能使散布的肿 瘤体发生显著减少，这部分地归因于不能制备和递送治疗有效的剂量。
[0016] 作者知晓没有报道详述非复制和非表达型弹状病毒衍生平台作为抗癌治疗剂的 用途。本公开内容的非复制型病毒衍生颗粒（non-replicatingvirus-derivedparticle， NVRP)，特别是非复制型弹状病毒衍生颗粒（non-replicatingrhabdovirus-derived particle，NRRP)是被修饰以缺乏在细胞之间扩散的能力的野生型病毒颗粒。一旦被改造， 非复制型病毒衍生颗粒（NVRP)就不能维持病毒体复制。
[0017]NVRP的独特之处在于其保留对永生化细胞的向性（tropism)，例如溶细胞向性。 这意味着NVRP将优先在永生化细胞（例如肿瘤细胞或癌细胞以及经转化的永生化细胞） 中诱导细胞死亡。NVRP的特别实例对永生化细胞具有先天性和/或适应性免疫刺激特性。
[0018] 在一方面，本公开内容描述了一种非复制型弹状病毒衍生颗粒，其缺乏在细胞之 间扩散的能力但对永生化细胞具有向性。所述向性可以是溶细胞向性。所述非复制型弹状 病毒衍生颗粒可具有对永生化细胞的先天性或适应性免疫刺激特性。
[0019] 在另一方面，本公开内容提供了非复制型弹状病毒衍生颗粒治疗过度增殖细胞群 或癌细胞群的用途。所述过度增殖细胞群优选具有造血性，并且优选是白血病细胞。所述 过度增殖细胞群可以是实体瘤细胞。
[0020] 在又一方面，本公开内容描述了一种治疗具有过度增殖细胞群或癌细胞群的患者 的方法。所述方法包括向所述患者施用非复制型病毒衍生颗粒。所述过度增殖细胞群可优 选具有造血性，优选是白血病细胞。过度增殖细胞群可以是实体瘤细胞。
[0021] 本领域的普通技术人员在阅读下文中结合附图对本发明一些特定实施方案的描 述后，本公开内容的其他方面和特征将变得明显。
[0022] 附图简述
[0023] 现在，将参考附图仅作为示例对本公开内容的一些实施方案进行描述。
[0024] 图IA是显示UV剂量对Vero和HDFN细胞之NRRP介导的细胞毒性的影响的图。在 UV-诱导的NRRP产生之后没有检测到GFP信号。在感染后72小时，使用刃天青（resazurin) 测定对生存力进行量化。将该实验的MOI设定为100个颗粒/细胞。误差条表示三个平行 实验之间的标准差。
[0025] 图IB是显示MOI对Vero和HDFN细胞中NRRP诱导的细胞毒性的影响的图，如作 为函数MOI的生存力所示。在感染后72小时，使用刃天青测定对生存力进行量化。误差条 表示三个平行实验之间的标准差。
[0026] 图2A是通过于感染后或处理后24小时和72小时对经PBS、活VSV-GFP或NRRP处 理的Vero细胞拍摄的荧光和亮视野显微图像显示Vero永生化细胞中的NRRP细胞毒性的 图像组。将这些试验中所使用的感染复数（multiplicityofinfection，M0I)设定为100 个颗粒/细胞。
[0027] 图2B是显示通过在处理后72小时对细胞生存力进行刃天青量化的NRRP细胞毒 性的图。误差条表示三个平行实验之间的标准差。
[0028] 图2C是显示所产生的病毒滴度的图。NAN指"非数"，此时未检测到病毒体。
[0029] 图3A是经PBS、活马拉巴病毒和马拉巴病毒衍生NRRP处理的白血病细胞（L1210) 和Vero细胞的荧光显微图像组（4X)。图像拍摄于处理后24小时。
[0030] 图3B是显示从肿瘤细胞获得的病毒滴度的图。
[0031] 图3C是显示于感染后72小时对L1210白血病细胞和HDF正常细胞之细胞生存力 进行刃天青量化的图。
[0032] 图4A是显示经PBS、活VSV-GFP或NRRP处理的L1210细胞和Vero细胞的荧光图 像的图像组。
[0033] 图4B是显示由L1210急性白血病细胞和Vero永生化细胞产生的病毒滴度的图。
[0034] 图5是与暴露于20, 000mJ/cm2UV剂量之病毒的基因组表达相比，NRRP基因组表达 的Western印迹图像，其中观察到细胞毒性丧失，并且或活病毒作为对照。提及的Ix或2x 指上样到凝胶上的蛋白质的量。蛋白质提取于感染后15小时。
[0035] 图6A是经化学产生的NRRP和白消安产生的NRRP处理之Vero细胞的荧光和亮视 野图像组。
[0036] 图6B是经单独白消安以与图6A中产生NRRP所使用的相同剂量处理15小时的 Vero细胞的亮视野显微图像。
[0037] 图6C是经活VSV-GFP处理的Vero细胞的荧光和亮视野图像组。
[0038] 图7A是经NRRP处理的Vero细胞的亮视野和荧光图像组，所述NRRP通过获取IElO 的冷冻野生型VSV并将该制备物用15 kGy钴-60辐照产生。
[0039] 图7B是经活野生型VSV-GFP处理的Vero细胞的亮视野和荧光图像组。
[0040] 图7C是PBS中的Vero细胞的亮视野和荧光图像组。
[0041] 图8A是经PBS或NRRP以100的MOI处理的L1210细胞和HDF细胞的亮视野图像 组。
[0042] 图8B是显示对白血病细胞系和正常细胞系的生存力的刃天青量化的图。鼠细胞 系用*表不。
[0043] 图8C是对鼠的人JurkatT细胞急性白血病、鼠A20B细胞成淋巴细胞白血病、 A301T细胞成淋巴细胞白血病和HL60急性早幼粒细胞性白血病以及GM38和HDF正常细胞 系的PBS、活VSV-GFP或NRRP处理的荧光显微图像组。
[0044] 图9是显示对经PBS或NRRP处理之L1210细胞的AnnexinV-APC和7-AAD染色的 流式细胞术分析的图组。
[0045] 图10是说明对在用UV产生之NRRP和UV产生之NRRP与苯达莫司汀（300yM)的 组合作用处理72小时后取得的L1210急性白血病细胞系进行刃天青量化测定后的细胞生 存力的图。
[0046] 图11是说明对在用UV产生之NRRP和UV产生之NRRP与地塞米松（45yM)的组 合作用处理72小时后取得的L1210急性白血病细胞系进行刃天青量化测定后的细胞生存 力的图。
[0047] 图12是说明对在用UV产生之NRRP和UV产生之NRRP与多柔比星（0. 025yM)的 组合作用处理72小时后取得的L1210急性白血病细胞系进行刃天青量化测定后的细胞存 活力的图。
[0048] 图13是说明对在用UV产生之NRRP和UV产生之NRRP与长春新碱（0. 0125yM) 的组合作用处理72小时后取得的L1210急性白血病细胞系进行刃天青量化测定后的细胞 生存力的图。
[0049] 图14是说明对在用UV产生之NRRP和UV产生之NRRP与伊达比星（0. 05yM)的 组合作用处理15小时后取得的K562Ph-阳性髓细胞白血病细胞系进行刃天青量化测定后 的细胞生存力的图。
[0050] 图15A是由LeBoeuf等开发之模拟正常细胞和抗病毒信号传导途径具有缺陷的 肿瘤中刺激NRRP细胞毒性的现象学模型。为了说明NRRP动力学，将原始模型通过去除病 毒复制（X)进行改造。点划线说明与肿瘤细胞相关的IFN缺陷。
[0051] 图15B是显示抗病毒信号传导途径中的缺陷与NRRP处理72小时后的生存力之间 的模拟关系的图。
[0052] 图15C是显示在存在或不存在IFN的情况下MOI与正常HDF细胞中在NRRP感染 后72小时的生存力之间的体外关系的图。
[0053] 图15D是显示在存在或不存在IFN的情况下MOI与白血病L1210细胞中在NRRP 处理后72小时的生存力之间的体外关系的图。
[0054] 图16A是经PBS或NRRP处理的两个慢性髓细胞白血病-原始细胞危象患者的亮 视野显微图像组。
[0055] 图16B是来自人患者外周血样品的急性白血病（CML原始细胞危象）的荧光显微 图像组（4X)。从经PBS、活VSV-GFP或编码GFP的NRRP处理的外周血收集的白血病富集样 品。图像为以MOI= 100感染后24小时。
[0056] 图16C是在处理后48小时对两个经PBS或NRRP(M0I= 100)处理之CML原始细 胞危象患者样品的Annexin-V和CD33染色的流式细胞术图表，其补充图16A和16C中所示 的数据。CD33+原始细胞群通过长期培养该细胞富集。
[0057] 图16D是显示对两个经PBS或NRRP处理之CML原始细胞危象患者样品的⑶33染 色的流式细胞术分析的图。
[0058] 图17A是经PBS或NRRP处理18小时的健康骨髓样品的亮视野显微图像组。
[0059] 图17B是显示对经PBS或NRRP处理65小时之健康骨髓样品的Annexin-V染色的 量化的图。
[0060] 图18A是显示鼠原始细胞危象处理模型中存活曲线的图。在小鼠于第一天遭受 L1210攻击后，使小鼠接受三个日剂量的NRRP或PBS。
[0061] 图18B是显示对在急性原始细胞危象期间携带L1210的小鼠中NRRP诱导的细胞 因子之基于Luminex的量化的图组。经NRRP处理小鼠之所有鉴定的细胞因子都被诱导超 过2倍，并且是统计学上显著的（非配对t-检验pV< 0. 05)。pV已经过校正以解释多重 假设检验（Beniamini和Hochberg方法）。
[0062] 图19是显示免疫原性凋亡的鼠免疫活性模型中存活曲线的图。在第一天的L1210 攻击之前，使小鼠接受3个每周剂量的用或未用NRRP孵育的y-辐照的L1210细胞。
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