一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于啤酒技术领域，用于啤酒污染菌检测方法，特别涉及一种基于多重 PCR技术以及毛细管电泳分离技术，用于啤酒中污染菌巨型球菌和果胶杆菌及乳酸片球菌 的快速筛选方法。
【背景技术】
[0002] 啤酒的酿造过程是建立在纯啤酒酵母的发酵和对污染微生物控制的基础上的，啤 酒中主要的污染微生物是乳酸菌（Lactobacillus)，此外，还有巨型球菌（Megasphaera)、 果胶杆菌（Pectinatus)和乳酸片球菌Pediococcus)。厌氧菌Megasphaer属巨型球菌、 Pectinatus属果胶杆菌和Pediococcus属乳酸片球菌会产生异味物质和引起啤酒浑池，从 而引起啤酒变质。
[0003] 对于啤酒微生物的检测方式主要分为两类，第一类是基于培养基的传统培养法， 国内外大多数啤酒厂采用此类方法，但检测时间长，且只能定量不能定性到种属，因此无法 及时指导生产技术人员对啤酒生产过程进行监控；第二类是基于PCR技术的分子生物学检 测方法，PCR技术从核酸、基因水平极大地提高了检测效率及灵敏度，能够定性到种、属或一 类目标菌，检测快速且定性能力强，因此无论对于成品啤酒质量的监控，或者生产过程问题 的溯源排查，PCR技术的应用都具有广阔的前景和深远的意义，但一次反应只能检测一类微 生物。
[0004] 大量实验已证实，对啤酒有害的乳酸菌（Lactobacillus)虽然为厌氧菌，但在 有氧条件下仍较容易生长，因此容易培养和检测。巨型球菌（Megasphaera)、果胶杆菌 (Pectinatus)和乳酸片球菌（Pediococcus)为极度厌氧菌，鉴别是一项较复杂的工作，这 些微生物需要严格的厌氧培养条件和冗长的孵育时间，检测过程复杂，因而有必要进行更 快速的检测方法。但目前检测方法多为使用单重PCR对每个有害菌进行逐一检测，检测成 本高、耗时费力，且不能一次反应得出检测结果，不利于大量样品的快速检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的缺陷，克服常规啤酒中污染菌巨型球菌、果胶杆 菌和乳酸片球菌检测技术操作繁琐，费时耗力等不足，提供一种由3对引物组成的引物体 系，通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从 而实现对啤酒生产过程快速确定啤酒中是否存在污染菌的检测。
[0006] 本发明的技术方案是：
[0007] 本发明对检测样品进行分析，若能检测出巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤 酒污染菌其中任意一种，则说明样品中含有具有啤酒污染能力的啤酒污染菌。
[0008] 本发明一种啤酒污染菌的快速筛查方法，采用3重PCR同时扩增3种污染菌的基 因16s rRNA，再通过毛细管电泳分离所述3重PCR扩增产物，所述3重PCR反应中应用引物 SEQ ID NO. 1 ~6。
[0009] 本发明的啤酒污染菌的快速筛查方法的方法，所述方法具体步骤如下：
[0010] (1)啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
[0011] 将检测啤酒样品在厌氧环境中26°C静置过夜富集培养；通过真空栗过滤收集细 胞沉淀于滤膜上；将滤膜转移至反应试管，加入50mM EDTA 480ul再加入10mg/ml溶菌酶 120ul，37°C孵育60min，13, 000X g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取啤酒污染 菌的DNA模板；
[0012] (2)多重 PCR 扩增：
[0013] 将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
[0014] 所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO. 1~6应用引物，所述的多重PCR扩增反 应体系为20ul由100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl 24ul， 5XPCRBuffer 4ul，5U/ul的Taq聚合酶0. 7ul，DNA模板lul，余量的双蒸水组成；其中正向 混合引物中SEQ ID NO. 1引物、SEQ ID N0. 3引物、SEQ ID N0. 5引物的浓度比为1:1:1，反 向混合引物中SEQ ID N0. 2引物、SEQ ID N0. 4引物、SEQ ID N0. 6引物的浓度比为1:1:1 ;
[0015] 所述的多重PCR扩增反应的条件是95°C预变性10min;以94°C变性30s ;58°C退火 30s;70°C延伸lmin为1个循环，共进行35个循环；4°C保温；
[0016] 表1本发明设计的用于污染菌的16s rRNA基因检测的3重引物体系各引物序列
[0017]
[0018]
[0019] ⑶毛细管电泳分离条件：
[0020] 分离体系：lul所述步骤（2)中所得的扩增产物与体积含量为95%的去离子甲 酰胺38. 5ul，400bpDNA MarkerO. 5ul混合均匀；分离条件：在50°C、6. 0KV电压下，分离 35min ；
[0021] (4)检测鉴定：所述步骤（2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多 重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号，3个基因的片段长度为161bp、 181bp、176bp相应位置分别得到巨型球菌、果胶杆菌和乳酸片球菌的特征峰。
[0022] 表2巨型球菌、果胶杆菌和乳酸片球菌基因特征峰位置
[0023]
[0024] 本发明的有益效果是：与现有技术相比本发明具有如下特点：
[0025] 其一，本发明可在同一PCR管中进行，操作简单，能快速确定啤酒中是否存在污染 菌，且检测结果准确；
[0026]其二，通过分析16s rRNA基因确定极度厌氧菌巨型球菌（Megasphaera)、果胶杆 菌（Pectinatus)和乳酸片球菌（Pediococcus)在啤酒中的微量存在，及时发现啤酒中有害 菌，实现有效的监测及预防作用；
[0027] 其三，本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在 一次反应中集成检测3种抗酒花基因极度厌氧菌，节约了检测成本，节省了检测时间，检测 时间由原7~14天缩短到8h。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明具体实施例1的多重PCR-毛细管电泳谱图；
[0029] 图2为本发明具体实施例2的多重PCR-毛细管电泳谱图。
【具体实施方式】
[0030] 下面对本发明做进一步分析。
[0031] 实施例1 :
[0032] (1)啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
[0033] 挑取平板培养基上长出的乳酸片球菌Pediococcus damnosus单菌落加入10mL成 品酒液中，混勾，制成菌悬液；取lmL该菌悬液加入1. 5ml离心管中，13, 000Xg离心2min， 收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul的50mM EDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ ml溶酶菌，37°C孵育60min，13,000Xg离心2min，移去上清液。之后按照Qiagen公司 的Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取啤酒污染菌的DNA模板，并使 用紫外分光光度计在260nm波长条件下测定提取的DNA质量，将DNA溶液稀释至250ng/ ul，-20°C保存备用。
[0034] (2)三重PCR扩增
[0035] 将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
[0036] 所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO. 1~6,所述的多重PCR扩增反应体系为 100nM 正向混合引物 2ul，100nM 反向混合引物 2ul，25mM 的 MgCl24ul，5 X PCRBuf f er4ul，5U/ ul的Taq聚合酶0. 7ul，DNA模板lul，补足双蒸水使总体积为20ul ;
[0037] 所述的多重PCR扩增反应的条件是95°C预变性lOmin ;以94°C 30s，58°C 30s， 70°Clmin为1个循环，共进行35个循环；4°C保温；
[0038] (3)毛细管电泳分离条件
[0039] 分离体系：lul所述步骤（2)中所得的扩增产物与95%去离子甲酰胺38. 5ul， 400bpDNA MarkerO. 5ul 混合均勾；
[0040] 分尚条件：在50°C、6. OKV电压下，分尚35min ;
[0041] (4)数据分析
[0042] 使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXP Genetic Analysis System分析系统自动对 分离结果进行分析，结果图1所示，乳酸片球菌Pediococcus damnosus基因被检出，检测 过程酒体对检测结果没有影响，使用本发明能够捕捉到样品中Pediococcus damnosus 16s rRNA基因的特征峰。
[0043] 实施例2 :
[0044] (1)啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
[0045] 取某啤酒厂生产车间500mL生酒10瓶，使用孔径为0.45 ym的滤膜分2次进行 过滤，每次使用1片滤膜过滤250mL，对一片滤膜使用啤酒有害菌检测培养基MRS-琼脂在 26°C，经7天厌氧培养后检测得到21个菌落，并以此作为实验对照；对另一片滤膜，使用 lmL无菌水进行震荡洗涤，收集洗涤液加入