1. 5ml离心管中，13, 000Xg离心2min，收集细 胞沉淀，移去上清液；加入480ul 50mM EDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶 菌，37°C孵育60min，13, 000Xg离心2min，移去上清液。之后按照Qiagen公司GenomicDNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取啤酒污染菌的DNA模板；
[0046] (2)三重PCR扩增
[0047] 将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
[0048] 多重PCR反应体系使用Thermo-DNA Polymerase DNA试剂盒，使用3重PCR反应 体系，所用引物体系为表1所述的SEQ ID N0. 1-6,所述的多重PCR扩增反应体系为100nM 正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgC124ul，5XPCR缓冲液4ul，5U/ul 的Taq聚合酶0. 7ul，DNA模板lul，补足双蒸水使总体积为20ul;
[0049] 所述的多重PCR扩增反应的条件是95°C预变性lOmin ;以94°C 30s，58°C 30s， 70°Clmin为1个循环，共进行35个循环；4°C保温；
[0050] (3)毛细管电泳分离条件
[0051] 分离体系由lul上述多重PCR扩增产物与95%去离子甲酰胺38. 5ul，400bpDNA MarkerO.5ul混合均勾构成；
[0052] 分尚条件：在50°C、6. 0KV电压下，分尚35min;
[0053] (4)数据分析
[0054] 使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXP Genetic Analysis System分析系统自动 对分离结果进行分析，得到多重PCR-毛细管电泳谱图，结果如图2所示，检测出巨型球菌 (Megasphaera)、果胶杆菌（Pectinatus)和乳酸片球菌（Pediococcus) 16s rRNA 基因的特 征峰，说明样品中含有具有啤酒污染能力的啤酒污染菌，且与对照培养实验结果相吻合。
[0055] 实施例3 :
[0056]乳酸菌（Lactobacillus)是啤酒中另一种常见污染菌。本实例可以证明本发明对 巨型球菌（Megasphaera)、果胶杆菌（Pectinatus)和乳酸片球菌（Pediococcus)的检测特 异性，即本发明的检测方法在仅乳酸菌（Lactobacillus)存在情况下，未显示特征峰，乳酸 菌（Lactobacillus)存在不会对检测产生干扰。
[0057] 本实例米用常见污染菌短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌 Lactobacillus casei、乳酉爱杆菌Lactobacillus coryniformi、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum作为干扰菌。
[0058] 本发明的操作步骤如实施例1或2所述。
[0059] (1)啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
[0060] 分别挑取平板培养基上长出的短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌 Lactobacillus casei、乳酉爱杆菌Lactobacillus coryniformi、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum单菌落加入10mL成品酒液中，混勾，制成菌悬液；取lmL该菌悬液加入1. 5ml离 心管中，13,000\8离心21^11，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480111的501111^0了4彻底重 悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37°C孵育60min，13, 000Xg离心2min，移去上清液。 之后按照Qiagen公司的Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取啤酒污染 菌的DNA模板，并使用紫外分光光度计在260nm波长条件下测定提取的DNA质量，将DNA溶 液稀释至250ng/ul，-20°C保存备用。
[0061] (2)三重PCR扩增
[0062] 将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
[0063] 所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO. 1~6,所述的多重PCR扩增反应体系为 100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5 X PCRBuf f er4ul，5U/ ul的Taq聚合酶0. 7ul，DNA模板lul，补足双蒸水使总体积为20ul;
[0064] 所述的多重PCR扩增反应的条件是95°C预变性10min ;以94°C 30s，58°C 30s， 70°C lmin为1个循环，共进行35个循环；4°C保温；
[0065] (3)毛细管电泳分离条件
[0066] 分离体系：lul所述步骤（2)中所得的扩增产物与95%去离子甲酰胺38. 5ul， 400bpDNA MarkerO.5ul混合均勾；
[0067] 分尚条件：在50°C、6. 0KV电压下，分尚35min ;
[0068] (4)数据分析
[0069] 使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXP Genetic Analysis System分析系统自动对 分离结果进行分析，结果显示，没有特征峰出现，即乳酸菌（Lactobacillus)的存在对检测 结果没有影响，不会出现假阳性结果。
[0070] 序列表
[0071]
【主权项】
1. 一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法， 其特征在于该方法包括以下步骤： 步骤（1)、啤酒污染菌的培养及DNA模板提取： 将检测啤酒样品在厌氧环境中静置过夜富集培养，过滤收集细胞沉淀；然后在细胞沉 淀中依次加入 50mM EDTA 480ul、10mg/ml 溶菌酶 120ul，37°C孵育 60min，13, OOOXg 离心 2min，移去上清液；最后米用试剂盒提取啤酒污染菌的DNA模板； 步骤（2)、多重PCR扩增： 将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增，得到扩增产物； 所述的多重PCR扩增反应体系为20ul由IOOnM正向混合引物2ul，IOOnM反向混合引 物 2ul，25mM 的 MgCl24ul，5 X PCRBuf f er 4ul，5U/ul 的 Taq 聚合酶 0? 7ul，DNA 模板 Iul，余 量的双蒸水组成；其中正向混合引物为SEQ ID NO. 1、3、5的混合引物，反向混合引物为SEQ ID NO. 2、4、6的混合引物； 步骤（3)、对含有上述扩增产物的分离体系进行毛细管电泳分离； 步骤（4)、检测鉴定：所述步骤（2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过 多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号，判断是否在基因片段长度为 161bp、181bp、176bp相应位置处出现特征峰；若在161bp相应位置处出现特征峰，则判断为 该检测样品中含有巨型球菌；若在ISlbp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中 含有果胶杆菌；若在176bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有乳酸片球 菌。2. 如权利要求1所述的一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污 染菌的快速检测方法，其特征在于步骤（2)所述的多重PCR扩增反应体系中正向混合引物 中SEQ ID NO. 1引物、SEQ ID NO. 3引物、SEQ ID NO. 5引物的浓度比为1:1:1，反向混合引 物中SEQ ID NO. 2引物、SEQ ID NO. 4引物、SEQ ID NO. 6引物的浓度比为1:1:1。3. 如权利要求1所述的一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污 染菌的快速检测方法，其特征在于步骤（2)所述的多重PCR扩增反应的条件是95°C预变性 IOmin ;以94°C变性30s ;58°C退火30s ;70°C延伸Imin为1个循环，共进行35个循环；4°C 保温。4. 如权利要求1所述的一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污 染菌的快速检测方法，其特征在于步骤（3)所述的毛细管电泳分离体系包括Iul步骤（2) 所得的扩增产物、体积含量为95%的去离子甲酰胺38. 5ul、400bp DNA Marker 0. 5ul。5. 如权利要求1所述的一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒 污染菌的快速检测方法，其特征在于步骤（3)所述的毛细管电泳分离条件如下：在50°C、 6. OKV电压下，分离35min。
【专利摘要】本发明公开一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法。该方法包括啤酒污染菌的培养及DNA模板提取，然后通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现对啤酒生产过程快速确定啤酒中是否存在污染菌的检测。本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在一次反应中集成检测3种抗酒花基因极度厌氧菌，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由原7～14天缩短到8h。
【IPC分类】C12Q1/04, C12R1/01, C12Q1/68
【公开号】CN105132561
【申请号】CN201510582957
【发明人】沈洁
【申请人】杭州电子科技大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月14日