最终抗体注射/施用和/或放置于动物体内。此工具可以是注射器、移液管、钳子和/或任何此类医学上批准的递送工具。
[0103]F.实施例
[0104]包含下列实施例以展示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解的是，下文实施例公开的方法代表本发明人发现在本发明的实施中工作良好的方法，因此可被认为构成其实施的优选形式。但是，本领域技术人员应当理解的是，在本公开内容的教导下，在公开的具体实施方案中可进行许多改变，并仍获得类似或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。
[0105]实施例1-筛选、鉴定和使用本发明人MAb的方法
[0106]材料。如之前所述制备人蛋白C、牛凝血酶(Esmon等人，1993 ;在此通过引用以整体并入本文)。重组 APC(Xigris)来自 Eli Lilly。Spectroxyme PCa 来自 AmericanDiagnostica。1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰胆喊(PC)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸(PS)和1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(PE)来自Avanti Polar Lipids，Inc.。人内皮细胞来源的EA.hy926细胞被维持在补充了 10 %胎牛血清、L-谷氨酰胺和HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)的 DMEM(Dulbecco' s modified Eagle' s medium)中。用来自Molecular Probes的荧光素-EX蛋白标记试剂盒根据制造商说明制备荧光素标记的APC(FL-APC)。在这些实施例中，没有用“活化的”修饰的“蛋白C”指未活化蛋白C。
[0107]小鼠抗人蛋白C和APC单克隆抗体的产生。通过标准技术开发抗人蛋白C或APC的小鼠单克隆抗体(mAb) (Rezaie and Esmon, 1992) 0
[0108]筛选蛋白C或APC的特异性mAb。通过FACS筛选mAb阻断FL-APC与EA.hy926细胞结合的能力而获得了人蛋白C mAb 1574和1580(HPC1575和HPC1580)。简要地，将EA.hy926细胞与50nM FL-蛋白C和10nM多种抗蛋白C的单克隆抗体在含有0.5% BSA、3mM CaCljP 0.6mM MgCl 2的HBSS (Hanks'平衡盐溶液)缓冲液中一起在冰上孵育30分钟，对其进行FACS分析。通过ELISA测定筛选mAb与APC结合而不与蛋白C结合的能力而获得了人 APC mAb 1573 (HAPC 1573)。简言之，用 15mM Na2CO3^ 35mM NaHCO3、ρΗ9.6 的缓冲液中的5微克/毫升不同的mAb在4摄氏度下包被96孔MaxiSorp板(NUNC)过夜。用含有ImM CaClJ^ TTBS (含有0.05%吐温-20的TBS) (TTBS钙缓冲液)清洗所述板，用在TBS (20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH7.5)中 0.1 % 明胶封闭 I 小时，用 TTBS 钙缓冲液再次清洗，与TTBS钙缓冲液中的100ng/ml蛋白C或APC —起孵育I小时。用TTBS钙缓冲液清洗之后，将所述板与2微克/毫升生物素化的HPC1580 —起孵育I小时，再次用TTBS钙缓冲液清洗，用TTBS钙缓冲液中I微克/毫升链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物一起孵育另外I小时。用TTBS钙缓冲液最后一次清洗并添加对硝基苯磷酸盐液体底物(Sigma)后，在Vmax微板读数仪上读取405nm处的终点吸光度。
[0109]针对血浆中APC的ELISA测定。所述测定从前述用于筛选针对APC的mAb的ELISA测定改变而来。简言之，用5微克/毫升HAPC1573包被所述板，用含有IX酪蛋白(VectorLab)的TBS封闭，再次用TTBS钙缓冲液清洗。将重组APC以0_8ng/ml掺入到含有1mM苯甲脒、ImM EDAT和0.25X酪蛋白缓冲液(稀释缓冲液)或1:4稀释的人血浆的TTBS中，将所述板中的样品孵育I小时。用TTBS钙缓冲液清洗后，将板与含1mM苯甲脒、5mM CaCl2和0.25X酪蛋白缓冲液的TTBS中I微克/毫升生物素化的HPC1575 —起孵育I小时。用TTBS钙缓冲液清洗后，将所述板与含1mM苯甲脒、5mM CaCljP0.25X酪蛋白缓冲液的TTBS中0.5微克/毫升的链霉亲和素-HRP —起再孵育I小时，用TTBS钙缓冲液再次清洗，用Ultra-TMB底物(Pierce)显色。在添加0.5M H2SO4停止HRP酶促反应后读取0D450。
[0110]mAb对内皮细胞上FL-APC结合的影响。在存在或不存在多种浓度HAPC1573或HPC1575 的情况下，将 EA.hy926 细胞与含 0.5% BSA、3mM CaCljP 0.6mM MgCl 2的 HBSS 缓冲液中的50nM FL-APC在冰上一起孵育30分钟，对其进行FACS分析。
[0111]在血浆凝固测定中mAb对APC抗凝血活性的影响。使用ST4凝血仪器(Diagnostica Stago)在改良的因子Xa单级凝固测定中确定mAb对血楽中APC抗凝血活性的影响。在标准测定中，向人正常血库血浆添加调节量的X-CP (来自鲁塞尔蝰蛇毒的因子X-活化酶)，以在含0.1% BSA的TBS中磷脂囊泡(最终10微克/毫升40% PE, 20% PS和40% PC w/v)和CaCl2(6.25mM)混合物中得到30s的凝固时间。通过添加CaCl2起始凝固。在添加CaCl2之前，添加APC (最终200ng/ml)或HAPC1573(最终20微克/毫升)。
[0112]mAb对于APC对发色底物的酰胺裂解活性的影响。通过添加50mM HEPESUOOmMNaCl、pH7.5缓冲液中的50微升0_2mM系列稀释的Spectrozyme PCa来测定在存在或不存在66.7nM HPC1555或HAPC1573的情况下HBSS缓冲液(含有0.1 %牛血清白蛋白、3mMCaCl2、0.6mM 1%(:12的 HBSS)中 50 微升 1nM APC 的酰胺裂解活性。
[0113]组蛋白细胞毒性测定。在存在或不存在Opt1-MEM培养基(Invitrogen)中10nMAPC和200nM HAPC1573的情况下，将EA.hy926细胞与牛胸腺组蛋白H3或H4 (Roche)在37摄氏度下一起孵育I小时，然后在添加10微克/毫升碘化丙啶(PI)后在室温下孵育5分钟。清洗细胞，用H3TA/PBS使其脱壁，进行针对PI阳性染色的流式细胞术。
[0114]实施例2-筛选、鉴定和使用本发明的人MAb的结果
[0115]HAPC1573增强内皮上的APC结合。为了检测HAPC1575对内皮上APC的结合是否具有任何影响，本发明人将EA.hy926细胞与FL-APC在存在或不存在HAPC1573或HPC1575的情况下一起孵育，通过流式细胞术测定细胞上FL-APC的结合。流式细胞术的频率分布图显示HAPC1573增强了内皮上的FL-APC结合，而HPC1575抑制所述细胞上FL-APC的结合(图2)。HAPC1573促进内皮上的APC内化，FL-APC可通过APC的Gla结构域与细胞上的EPCR的相互作用内化到EA.hy926细胞中，EPCR阻断性Ab (JRK1494)或Gla结构域阻断性Ab (HPC1575)可阻断此内化(图3)。HAPC1573可促进FL-APC内化进细胞，EPCR阻断性Ab可完全阻断此作用(图3)。
[0116]HAPC1573改变APC针对发色底物的酰胺裂解活性。因为HAPC1573识别ELISA板和内皮细胞上的APC，本发明人研究了 HAPC1573是否可影响APC针对发色底物的酰胺裂解活性。合成肽底物通常是小分子，约几百道尔顿的分子量，针对血浆中丝氨酸蛋白酶的多数抗体对这些小底物的酶活性没什么影响。但是，HAPC1573显著改变了 APC对其发色底物Spectrozyme PCa 的动力学参数(图 4)。在 HAPC1573 存在时，APC 对 Spectrozyme PCa 的km为15nM，而在Ab不存在或者HPC1555存在时则为270nM。在HAPC1573存在时，APC对Spectrozyme PCa的kcat为18，而在Ab不存在或者HPC1555存在时则为67。在HAPC1573存在时APC对小肽底物的重大改变表明，该mAb识别APC中接近活性位点的表位，Ab与抗原的相互作用显著增加了 APC对小肽底物的亲和力，而降低了产物从APC催化部位离开的速率。
[0117]HAPC1573阻断血浆中APC抗凝血活性。图5显示，在因子Xa起始单级血浆凝固测定中HAPC1573几乎完全消除了 APC的延时作用，表明HAPC1573与APC的相互作用阻止APC切割因子Va。
[0118]HAPC1573对APC切割细胞外组蛋白的影响。最近，本发明人发现APC可切割细胞外组蛋白，并保护内皮免受组蛋白的细胞毒性(稿件正在准备中)。因为HAPC1573改变了APC对发色底物的酰胺裂解活性并阻断血浆中APC的抗凝血活性，本发明人研究了此mAb是否可影响APC切割细胞外组蛋白H3和H4以及影响APC为内皮提供针对组蛋白H3和H4细胞毒性的细胞保护作用。
[0119]出乎意料地，HAPC1573不抑制而实际上提高APC对组蛋白H3和H4的切割(图6)。一致地，HAPC1573不抑制而是略微增强APC在内皮上抗组蛋白H3和H4的细胞保护活性(图 7A-B)。
[0120]实施例3-筛选、鉴定和使用本发明的人MAb的讨论
[0121]蛋白C由与内皮上凝血调节蛋白复合的凝血酶所活化。与体内活性凝血酶的数秒短促寿命不同，人APC在其产生后在循环中具有约20分钟的半衰期(Berg等人，2003)。因此，可以测定血浆中的APC水平，从而研究在多种病理生理条件下的调控。
[0122]目前可用于测定APC的方法基于酶捕获测定，其使用捕获APC的抗体，然后用发色底物测定APC活性。因为这些测定中所用的所有抗体都不仅识别APC而且还识别其酶原(蛋白C)，又由于在正常循环中蛋白C浓度是APC的约1000倍，所以使用这些方法测定APC不是临床相关的。在诊断和治疗中，用于APC测定的快速且有力的方法是令人期望的。上文的结果显示，一种mAb (即HAPC1573)识别APC而不识别蛋白C，证明开发出了用于体内测定血浆中APC水平的方便的ELISA方法。通常，用此方法测定含有lng/ml APC的血浆样品需要不到4小时的时间，而使用酶捕获测定则需要19个小时或者甚至数周(Gruber andGr if fen, 1992 ；Liaw 等人，2003)。
[0123]最近的研究显示，APC的抗凝血活性对于其细胞保护功能不是必要的，但是APC对PARl的切割活性可能对其抗凋亡作用来说是必不可少的(Mosnier等人，2004)。但是，已经不仅在表达EPCR的内皮细胞中而且在其细胞表面上不表达EPCR的其它细胞(例如神经元和角化细胞)中显示出APC的细胞保护作用(Guo等人，2004 ;Berg等人，2003)，表明可能存在PARl介导的APC信号转导之外的机制。HAPC1573改变了 APC对发色肽底物的切割活性，在血浆凝固测定中也阻断了 APC抗凝血活性，表明此mAb识别APC活性位点附近的表位，并在抗体-抗原结合后改变其催化活性。
[0124]另一方面，HAPC1573不抑制而且实际上增强APC对细胞外组蛋白的切割，并且增强APC在内皮上针对组蛋白的细胞保护活性，表明APC切割活化因子V和VIII的抗凝血活性对其通过切割细胞外组蛋白的细胞保护活性而言不是必需的。与抗凝血活性无关的对细胞外组蛋白的切割可能是APC调节炎症和细胞保护的分子机制之一。